[发明专利]一种发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法

说明书

本发明属于医学微生物学技术领域，尤其是一种发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法，解决了现有技术中发热伴血小板减少综合征病毒株分离比较困难，分离得到的菌株纯度低，在细胞中培养比较困难，目前尚未有分离发热伴血小板减少综合征病毒的最佳方案的问题，所述发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法，包括以下步骤：将发热伴血小板减少综合征病毒感染Vero细胞，培养后收集细胞培养物上清液；过滤、加蔗糖垫层离心，取离心沉淀物即得。本发明分离方法简便易操作，且耗时较短，其分离得到的发热伴血小板减少综合征病毒株纯度较高，可用于后续发热伴血小板减少综合征的致病机制及特异性临床表现的研究，意义深远。

技术领域

本发明涉及医学微生物学技术领域，尤其涉及一种发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法。

背景技术

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一种急性传染性疾病，由布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome bunyavirus,SFTSV)感染所致，该新病毒隶属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，2009年在中国首次被发现，近年来已在大半个中国地区流行传播，致数千人患病甚至死亡，平均病死率约10％，陆续地在韩国、日本和美国也有类似疫情报道。该疾病主要临床症状表现为高热、厌食、肌肉痛、寒战、淋巴结肿大、白细胞降低、血小板减少和多器官功能衰竭等，少数患者病情较重且发展迅速，可因多脏器功能衰竭而死亡。截至2011年底的监测和调查结果显示，病例多发生于4～10月份，以青壮年居多。潜伏期尚不十分明确，可能为1周～2周。急性起病，主要临床表现为发热，体温多在38℃以上，重者持续高热，可达40℃以上，部分病例热程可长达10天以上。伴乏力、明显纳差、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。查体常有颈部及腹股沟等浅表淋巴结肿大伴压痛、上腹部压痛及相对缓脉。少数病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血(DIC)等多脏器功能衰竭死亡。

发热伴血小板减少综合征病毒株是用于研究、分析、明确发热伴血小板减少综合征的致病机制及特异性临床表现的重要部分。因此，进行发热伴血小板减少综合征病毒的快速分离，从而进行后续的疾病机制及检测方法预防方法的研究至关重要。然而，现有技术中，发热伴血小板减少综合征病毒株分离比较困难，分离得到的菌株纯度低，在细胞中培养比较困难。目前尚未有分离发热伴血小板减少综合征病毒的最佳方案。基于上述陈述，本发明提出了一种发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中发热伴血小板减少综合征病毒株分离比较困难，分离得到的菌株纯度低，在细胞中培养比较困难，目前尚未有分离发热伴血小板减少综合征病毒的最佳方案的问题，而提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法。

一种发热伴血小板减少综合征病毒株的分离方法，包括以下步骤：

(1)将发热伴血小板减少综合征病毒感染Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，培养5-7天，待超过60％的细胞出现细胞病变效应后，收集细胞培养物上清液；

(2)使用0.22μm滤头于生物安全柜中过滤步骤(1)中收集的细胞培养物上清液；

(3)准备超速离心管，在超速离心管底部加入8ml的浓度为20％的蔗糖溶液，形成蔗糖垫层；

(4)沿着步骤(3)中的超速离心管管壁，在蔗糖垫层上慢慢加入步骤(2)中过滤得到的细胞培养物上清液30ml；

(5)将步骤(4)中的超速离心管在4℃的温度下离心，设置离心速度为40000g，离心时间为4h；

(6)离心结束后，倒置超速离心管，待试管内液体流干，弃掉离心后的上清液及蔗糖垫层，保留超速离心管底部的沉淀物，即得纯化的发热伴血小板减少综合征病毒株。