[发明专利]根肿菌效应蛋白PBRA_2565及其应用

说明书

本发明属于生物技术及作物栽培和病害防治领域，具体公开了一种根肿菌效应蛋白PBRA_2565，其通过调控榨菜根际微生物可以减轻根肿病的发病率，在防治根肿病方面具有应用价值。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域及作物栽培和病害防治领域，具体而言，涉及根肿菌效应蛋白及其应用。

背景技术

根肿病是十字花科植物最具破坏性的病害，在世界范围内造成了巨大经济损失。该病的病原菌为云薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)，专性寄生，在寄主植物根部细胞内发育形成休眠孢子。根肿菌调节植物代谢过程，刺激植物分泌生长素，导致根部形成肿瘤，致使植株的水分和营养吸收能力下降。发病植株根瘤表皮开裂，土壤中其他病原真菌和细菌进入根部，导致根部腐烂，植株死亡。同时大量的休眠孢子被释放到土壤中(KageyamaAsano,2009)。根肿菌的休眠孢子可在土壤中存活最长达20年。由于根肿菌属于内寄生，且在土壤中长期休眠，导致该病极难防治，一旦发生，难以消除。随着十字花科作物种苗的调运，根肿病在我国的传播范围日益扩大，主要分布在东北地区、华中地区、西南地区、长江中上游地区等地(李金萍等,2012)，严重威胁我国十字花科蔬菜的生产。

茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)为十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种，以其为原料加工而成的榨菜是世界三大腌菜之一。“涪陵榨菜”已经成为我国的特色农业产品，创造了巨大的经济效益(高明泉等,2002)。然而，在茎瘤芥栽培过程中受到根肿病严重危害，每年导致大量的产量和经济损失，成为生产上亟待解决的问题。目前在生产上主要防治的方法有轮作，清除和烧毁病株，施用石灰调节土壤酸碱度，草木灰土盖种和化学防治等。此外，由于该病作用于茎瘤芥根部加之重庆地区土壤粘度较大、石块较多、冬季雨水充足使土壤的翻耕难度大，农药难以发挥作用。同时农药残留等问题也日益突出。抗病品种选育为十字花科植物抗根肿病提供了有效解决办法，如油菜、大白菜等已培育出抗病品种，但由于茎瘤芥属于野生四倍体，在抗病品种选育上难度大，目前尚未选育出抗病品种。因此，解析茎瘤芥根肿病发病机理，从多方面对茎瘤芥根肿病进行综合防治尤为重要。

根肿菌生活史分为：休眠孢子休眠和萌发阶段；根毛和表皮细胞侵染阶段；皮层侵染阶段。根肿菌生活史每个阶段会分泌蛋白效应子来促进其侵染寄主植物。丝氨酸蛋白酶Pro1参与第一阶段的休眠孢子萌发(Feng et al,2010)。在根毛和表皮细胞侵染阶段，根肿菌可能分泌蛋白酶和蛋白酶抑制子，如富含半胱氨酸的蛋白酶、甲基转移酶，抑制植物的免疫反应，阻止寄主植物细胞程序性死亡，提高侵染成功率(Siemens et al,2011)。在初生原质团和次生原质团形成阶段，根肿菌分泌一系列蛋白效应子调节植物激素分泌，如细胞分裂素生物合成、生长素稳态、水杨酸和茉莉酸代谢(Malinowski et al,2012)，激发根部细胞生长、延伸和分化，刺激细胞形成肿瘤。在游动孢子成熟阶段，根肿菌表达具有几丁质结合结构域效应子，清除几丁质片段，抑制植物的病原体分子激发的免疫反应。在次生游动孢子和次生原质团形成阶段，根肿菌可能表达控制植物防御反应和干扰植物分生组织活性的效应子(Ludwig-Müller et al,2015)。然而，在休眠孢子土壤休眠阶段和释放游动孢子侵染阶段，根肿菌如何克服土壤微生物的影响，是否分泌效应子来提高与其他微生物生态竞争能力有待揭示。

效应子是植物病原菌在侵染植物过程中产生的有助于其侵染和定殖的小分子物质，对植物生理或免疫进行调控，以阻止植物抗性反应(JonesDangl,2006)。大多数植物病原菌效应子属于分泌蛋白，富含半胱氨酸，含有N-端信号肽,氨基酸残基大约为50～300个,序列特异性高(Stergiopoulos et al,2009；Bolton et al,2010)。此外，植物病原菌产生的次生代谢产物和小分子RNA也具有效应子的功能(Wang et al,2016)。某些植物内生菌、共生菌，甚至腐生菌也能够产生效应子同源的分子物质(Rovenich et al,2014)。效应子能帮助病原菌突破植物自身的屏障，成功侵染植物。