[发明专利]妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法

说明书

本发明公开了妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，根据所需的层液，抽排处其他液体，在抽排时，按压定位板,吸料管随之下降，吸料管的底端能够准确深入到储纳试管的层液中，这时旋转丝杆，能够实现对活塞的提升，能够更加准确的对层液的分离，不需要逐层进行，能够提高分析料率，提高分析的准确度；在对试剂添加时，通过释放连接管上的阀门，气罐的高压气体进入U型管,U型管一端的气压增强，U型管另一端的药剂实现溢流，能够更加准确的实现对试剂的添加，操作简单、便捷、准确；通过利用密度梯度离心法分离血清中胎盘来源外泌体，通过基因芯片和实时荧光定量PCR检测miRNA表达情况，以ROC曲线分析其预测效能，能够及时预防疾病的发生能。

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体为妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法。

背景技术

外泌体是由细胞主动分泌的具有脂质双分子层膜结构的微小囊泡，近年研究发现，妊娠期间在母体循环中存在胎盘来源的外泌体，它们主要由胎盘滋养细胞和内皮细胞等生成并释放，可通过其携带的蛋白质、脂质和核酸等多种生物活性物质调控受体细胞功能，参与妊娠生理和病理过程，目前，有关妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体的成分和功能研究报道仍然较少；

在妊娠期糖尿病患者进行诊断时，不清楚糖尿病的诱发原因，不能在妊娠过程中及时的阻断，导致孕妇在妊娠期患糖尿病的风险增高，在分析样品进行离心过程中，排液过程复杂，需要逐层进行，操作效率低，分析表达效果不准确，在试剂添加时，添加的准确度不精，导致分析结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于提供妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，解决了不清楚糖尿病的诱发原因，不能在妊娠过程中及时的阻断，导致孕妇在妊娠期患糖尿病的风险增高，在分析样品进行离心过程中，排液过程复杂，需要逐层进行，操作效率低，分析表达效果不准确，在试剂添加时，添加的准确度不精，导致分析结果不准确的技术问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，步骤如下：

S1:在孕8~12周采集静脉血，静置1h，离心作业10min，静置后分离收集血清；

S2:转移至的移液枪管中，置于-80℃ 低温冰箱保存,取出血清样本200μL，离心作业10min，静置后取上清液;

S3:加入提取试剂混匀,静置30min，再次进行离心作业，在静置后，移除上层液体，在移液枪管中加入蔗糖液悬浮沉淀;

S4:采用RNAiso Plus试剂对胎盘来源外泌体总RNA进行抽提和纯化;

S5:应用试剂盒对7种差异表达的miRNA进行定量检测验证。

作为本发明进一步的方案：所述S4中，纯化过程通过利用密度梯度法纯化，通过透射电镜观察形态特征和免疫印迹法检测生物标记蛋白CD63、PLAP对胎盘来源外泌体进行鉴定。

作为本发明进一步的方案：在所述S2、S3和S4的作业过程中通过使用一体式的离心分离装置完成。

作为本发明进一步的方案：所述一体式的离心分离装置包括底板、离心电机、限位筒、离心筒、储纳试管、灯管、补料结构、密封结构和排料结构，所述底板的顶部安装有离心电机，所述离心电机的转轴上配合安装有离心筒，所述限位筒固定在底板的顶侧，所述离心筒的底部配合设置在限位筒的内部，所述离心筒的底部内壁上安装有储纳试管，所述离心筒的内壁上安装有灯管，所述密封结构安装在离心筒的顶部中心，所述密封结构和排料结构分别安装在离心筒的顶部两侧。