[发明专利]一段过表达丙酮酸脱氢酶复合物的核糖体位点序列及应用

说明书

本发明公开了一段能够过表达丙酮酸脱氢酶复合物的核糖体结合位点序列，利用该序列进行丙酮酸脱氢酶复合物的过表达能够有效的降低丙酮酸积累、生长抑制的雷伯氏肺炎杆菌中丙酮酸含量，从而改善了菌体的生长。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一段能够过表达酮酸脱氢酶复合物的核糖体结合位点序列及应用。

背景技术

丙酮酸(pyruvate)是原核生物代谢中重要的中间代谢产物，它是糖酵解途径的最终产物，丙酮酸能够转化为乙酰辅酶A，从而进入柠檬酸循环，为菌体的生长代谢提供能量，也可以转化为乳酸，为厌氧生长提供能量。在细胞生长的过程中，丙酮酸的含量都维持在一个较低的水平。而在丙酮酸代谢缺陷型菌株中会大量积累丙酮酸，丙酮酸作为有机酸，大量积累会对菌体造成不可逆的伤害，进而影响菌体的生长代谢。

基于上述问题，申请人设计了一段够过表达丙酮酸脱氢酶复合物(Pyruvatedehydrogenase complex，PDHC)的核糖体结合位点(ribosome bindsite，RBS)序列来过表达PDHC。使用该RBS序列能够过表达克雷伯氏肺炎杆菌来源的PDHC，使得丙酮酸代谢缺陷型克雷伯氏肺炎杆菌中丙酮酸的含量、改善了丙酮酸代谢缺陷型菌株的菌体生长。

发明内容

针对丙酮酸积累、生长抑制的问题，本发明的目的在于设计一段能够过表达PDHC的RBS序列，以及过表达PDHC的应用。

所述的RBS序列为SEQ ID NO 1。

所述的PDHC编码基因为克雷伯氏肺炎杆菌的基因aceE，aceF与lpdA。

所述的过表达PDHC的应用，是指通过质粒载体表达优化RBS的PDHC编码基因，降低了丙酮酸代谢缺陷型克雷伯氏肺炎杆菌中丙酮酸含量，改善了菌体的生长。

所述的含RBS序列过表达PDHC质粒载体的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)以克雷伯氏肺炎杆菌基因组为模板，分别含酶切位点和RBS序列的上下游引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7获得带有所述RBS序列和酶切位点的基因片段aceE、aceF和lpdA。

2)将基因aceE片段利用SpeⅠ进行酶切，基因aceF片段利用XbaⅠ进行酶切，后利用T4连接酶将两端基因连接在一起得到aceE－aceF片段，利用引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO5将aceE－aceF片段进行扩增；然后将扩增的aceE－aceF片段利用SpeⅠ进行酶切，基因lpdA片段利用XbaⅠ进行酶切，后利用T4连接酶将两段基因连接在一起得到了优化RBS的PDHC编码基因片段aceE－aceF－lpdA，然后利用引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 7对aceE－aceF－lpdA片段进行扩增。

3)将优化RBS的PDHC编码基因片段利用酶XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，质粒pETNar利用酶SpeⅠ和HindⅢ进行双酶切，利用T4连进行连接，连接后转化到大肠杆菌DH5α中，进行扩增，然后对质粒进行提取，即可获得过表达PDHC的重组质粒pETNarHRBSPDHC。

4)将获得的重组质粒转入丙酮酸代谢缺陷、丙酮酸积累、生长受到抑制的菌株中培养，即可降低菌体中丙酮酸含量，改善细胞生长。

附图说明

图1为基因aceE、aceF和lpdA扩增的凝胶电泳图；

图2为pETNar质粒图谱；

图3为pETNar质粒双酶切凝胶电泳图谱；

图4为优化RBS的PDHC编码基因aceE－aceF－lpdA(PDHC)片段扩增图谱；