[发明专利]一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置及方法

说明书

本发明涉及一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置及方法，属于三维光学显微成像技术领域。成像装置包括沿光路依次设置的超快激发光源模块、多模式光场产生模块、激光扫描模块与荧光收集和探测模块；还包括控制和数据采集模块、立体显示模块与电控样品台；多模式光场产生模块包括沿光路依次设置的扩束器、波前调制器件、孔径光阑及傅立叶变换透镜；利用可编程控制波前整形器件，产生不同焦深的激发光场，分别实现点扫描光学层切成像、线扫描光学投影成像以及双视角立体扫描实时立体成像三种成像模式，通过兼容的立体显示器对三维样品进行三种成像模式的实时观测。

技术领域

本发明涉及一种集成点扫描光学层切、线扫描光学投影和双视角立体扫描实时三维成像三种成像模式的显微成像装置和方法，属于三维光学显微成像技术领域。

背景技术

激光扫描显微镜在生命科学、材料等领域应用广泛。其中双光子激发激光扫描荧光显微是目前主流的用于活体深层组织成像的光学显微技术，自上世纪90年代提出后，至今已被应用到生物活体成像、发育生物学、材料科学等多个领域中，因其具有高穿透深度、低光损伤、高空间分辨率的优点而收到研究人员的广泛关注。但是由于其逐点扫描、逐层成像的三维成像方式限制了成像速度的提高，其三维成像速度一般不到1体帧/秒，三维动态变化需要数据重构之后才可以观测；而且此成像方式单层成像景深很短，无法观测大景深范围的动态变化。

为了提高三维显微成像速度，研究人员从多方面进行了努力：首先是采用具有更高扫描频率的器件，如共振振镜实现8KHz到16KHz的扫描，也可使用声光扫描器件实现频率更高的扫描，但是三维成像仍受限于慢的轴向移动速度，而且成像的视场较小。同时，这一类通过提高点扫描速度的方法，会减少聚焦的激发光束在单个成像点的停留时间，从而每个像素对应的荧光光子数会降低，泊松噪声的影响变得更加显著，图像信噪比下降。其次是利用多焦点激发和多像素探测方法来实现扫描成像的并行化。Bewersdorf等人提出利用微透镜阵列来产生多个激发焦点，并利用相机来记录荧光图像(J.Bewersdorf,R.Pick,andS.W.Hell,Multifocal multiphoton microscopy,Opt.Lett.23,655–657(1998))，但这类方法在深层组织成像中受到很大限制，因为荧光光子受到的散射随着成像深度的增加而加剧，最终使得多个焦点之间的串扰大大增加。另外一种思路是通过增加显微成像系统的景深，即扩展景深(EDOF)显微成像，特别是和能对组织深层成像的双光子激发激光扫描荧光显微成像结合起来，可以避免慢速的轴向扫描，从而提高三维成像速度。Dufour等人于2006年利用锥镜产生的贝塞尔光束完成了扩展景深的双光子荧光成像(P.Dufour,M.Piché,Y.De Koninck,and N.McCarthy,Two-photon excitation fluorescence microscopywith a high depth of field using an axicon,Appl.Opt.45,9246–9252(2006).)，但成像系统未采用显微物镜，光学分辨率很低，而且系统通过移动样品来代替激光扫描，成像速度很慢。同年，牛津大学的Botcherby等人提出了利用衍射光学元件产生贝塞尔光束的高分辨率双光子荧光成像(E.J.Botcherby,R.and T.Wilson,Scanning twophoton fluorescence microscopy with extended depth of field,Opt.Commun.268,253–260(2006).)，但是成像系统也是利用了样品台的扫描代替光束的扫描。

专利ZL201210384895.4和US 10,809,510 B2利用线状分布的准贝塞尔光束替代高斯光束聚焦的点状光场，提高了成像的景深，避免了沿样品深度方向的扫描，以牺牲三维成像区域的深度信息为代价快速获取此区域的投影成像。专利ZL201210384895.4提出手动平移锥镜实现对线状光束的角向偏移，但受限于此操作的时间延迟较大，亦无对应的电控和数据采集措施，无法对三维样品进行实时立体成像。