[发明专利]一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法

说明书

本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法，以羧基磁珠为介质，将特异性抗体与羧基磁珠偶联，进行病毒颗粒捕获分离，再进行QPCR检测。实验显示，本发明方法可以成功将样本中的病毒颗粒捕获分离，并且因磁珠偶联抗体的不同，可以将样本中不同组分的病毒颗粒区分。通过本发明方法，意外发现细胞上清、血清中病毒粒子成分有所不同，细胞上清中HBV DNA主要来源于衣壳病毒，完整病毒颗粒含量较少；而血清标本中衣壳病毒含量低于完整病毒颗粒。随着血清中HBV DNA拷贝数的增加，其血清中完整病毒颗粒的含量明显增加，提示完整病毒颗粒的检测可能作为新的血清标志物。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及HBV完整病毒颗粒，具体涉及一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种具有双链DNA基因组的假逆转录病毒。其重要的特征是HBV感染肝细胞后可以分泌多种形式的病毒颗粒，大致可以分为包含基因组及无基因组的病毒粒子。根据基因组的种类又可以分为HBV RNA类病毒粒子、HBVDNA病毒粒子与无基因组病毒粒子。以有无乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)为标准，又可以将不同基因组的病毒粒子划分为核衣壳病毒、包膜化病毒与亚病毒粒子。其中最具代表性的有亚病毒颗粒、NCs(nucleocapsid)颗粒、HBV RNA病毒粒子与完整病毒颗粒(HBV Dane颗粒)。NCs主要为包裹基因组的核衣壳病毒，根据包裹的基因组种类的不同分为成熟与不成熟两种，成熟的NCs包裹双链脱氧核糖核酸(double-stranded DNA，dsDNA)，而未成熟的NCs含有的基因组则为HBV复制中间体。研究显示只有成熟的NCs才能被包膜化形成完整病毒颗粒(Ning X,Nguyen D,Mentzer L,et al.Secretion of genome-free hepatitis Bvirus-single strand blocking model for virion morphogenesisof para-retrovirus[J].Plos Pathogens,2011,7(9):e1002255)。HBV血清中含有较多的亚病毒颗粒，其主要成分为丰富的HBsAg蛋白(Heermann KH,Goldmann U,Schwartz W,etal.Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence[J].Journal of Virology,1984,52(2):396)，它可以与宿主细胞分泌的表面抗体(hepatitis B surface antibody，HBsAb)反应，减少血清中HBsAb的含量，从而阻断这些抗体对HBV Dane颗粒的清除(Rydell GE,Prakash K,Norder H,et al.Hepatitis B surfaceantigen on subviral particles reduces the neutralizing effect of anti-HBsantibodies on hepatitis B viral particles in vitro[J].Virology,2017,509:67-70)。HBV Dane是一种球形颗粒，直径约为42nm，外含包膜蛋白(大、中、小表面蛋白)，内由乙肝核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBcAg)包裹部分双链DNA(partiallydouble-stranded DNA，rcDNA)形成的核衣壳组成。与HBsAg病毒颗粒相比，前者包含丰富的大表面蛋白(Large protein，Lp)，Lp蛋白是成熟NCs包膜化和完整病毒颗粒分泌不可缺少的成分(Bruss V,Ganem D.The role of envelope proteins in hepatitis B virusassembly[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(3):1059-63)。迄今为止，HBV Dane颗粒被认为是HBV分泌的多种病毒粒子中唯一具有传染性的病毒颗粒。其传染性大致有两个原因，一是包膜蛋白上含有可与肝细胞受体结合的结构域，从而介导HBV的感染；二为HBVDane颗粒可以将其内部携带的完整基因组运送到新的肝细胞，从而造成持续性感染。HBV不同形式的病毒粒子在病毒生命周期中各司其职，都有自己独特的作用，其中HBV Dane颗粒是HBV存在传染性最重要的成分，而NCs颗粒是保证其正确形成的关键性粒子。