[发明专利]一种基于荧光共振能量转移的活细胞单分子RNA标记方法

权利要求书

1.一种活细胞单分子RNA的标记方法，包括以下步骤：

1)构建目标RNA分子与dual-TS标签连接的融合表达载体，所述dual-TS标签包括一个或多个串联重复的dual-TS序列，每个dual-TS序列由能够被探针A识别的3’端序列TSa和能够被探针B识别的5’端序列TSb组成；

2)构建能够发生FRET的供体探针和受体探针，若以步骤1)中所述探针A作为供体探针，探针B作为受体探针，则所述供体探针是3’端带有供体荧光团、序列与TSa特异性互补的寡核苷酸探针，所述受体探针是5’端带有受体荧光团、序列与TSb特异性互补的寡核苷酸探针；若以步骤1)中所述探针B作为供体探针，探针A作为受体探针，则所述供体探针是5’端带有供体荧光团、序列与TSb特异性互补的寡核苷酸探针，所述受体探针是3’端带有受体荧光团、序列与TSa特异性互补的寡核苷酸探针；

3)将步骤1)得到的融合表达载体转染到活细胞中；

4)将步骤2)构建的供体探针和受体探针共同导入转染了融合表达载体的活细胞中；

5)通过探测活细胞中供体探针和受体探针所产生的FRET信号，监测被标记的目标RNA分子。

2.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤1)中所述dual-TS标签由8个串联重复的dual-TS序列组成。

3.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤1)中所述dual-TS序列为活细胞基因组中不存在的无义序列。

4.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤1)中所述dual-TS序列为：5’-CGACAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGCAAGCTCAGTCACGACATCACTTACGCT-3’；所述探针A的序列为：5’-CUCAGCGUAAGUGAUGUCGUGACUGAG-3’，所述探针B的序列为：5’-CUUCGUCCACAAACACAACUCCUGAAG-3’。

5.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤2)中所述供体探针和受体探针为带有抵抗核酸酶降解的化学修饰的RNA探针。

6.如权利要求5所述的标记方法，其特征在于，步骤2)中所述供体探针和受体探针上的化学修饰选自下列化学修饰中的一种或多种：2’-O-甲基化修饰、硫代磷酸修饰、锁核酸修饰、吗啉基修饰。

7.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤2)中所述供体荧光团和受体荧光团选自下列FRET荧光对中的一种：ATTO550/ATTO647N、ATTO488/ATTO550、Alexa546/Alexa647、CY3/CY5。

8.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤2)中若以探针A作为供体探针，探针B作为受体探针，则所述供体探针的5’端带有淬灭基团，所述受体探针的3’端带有淬灭基团；若以探针B作为供体探针，探针A作为受体探针，则所述供体探针的3’端带有淬灭基团，所述受体探针的5’端带有淬灭基团。

9.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤1)通过分子合成技术与分子克隆手段得到目标RNA和dual-TS标签的融合表达载体，然后在步骤3)通过转染试剂将其转染到活细胞中；步骤4)将步骤2)合成的供体探针和受体探针通过电转的方式共同导入转染了融合表达载体的活细胞中。

10.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，步骤5)通过荧光显微镜成像技术原位、实时、动态监测活细胞中目标RNA的动态行为。