[发明专利]基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测样品的基因组DNA；

2）表达并纯化Cas12a；

3）设计crRNA和LAMP引物；

4）LAMP扩增：以步骤1）提取的基因组DNA作为模板，在含有LAMP引物的LAMP体系中进行扩增，得到LAMP产物；

5）荧光可视检测：将含有LAMP产物、Cas12a、crRNA、硫磺素T、富G序列和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10~60 min，通过荧光可视检测样品中是否含有副溶血弧菌基因；

所述步骤5）中：

当LAMP产物中含有副溶血弧菌的特异扩增基因时，Cas12a-crRNA与所述LAMP产物上的特征序列结合，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割G四联体结构并使其无法增强ThT荧光，溶液不发射荧光；

当LAMP产物中不含有副溶血弧菌的特异扩增基因时，Cas12a的附属切割活性无法被激活，G四联体结构保持完整，溶液发射绿色荧光；

所述步骤5）中：

LAMP扩增产物的体积为1-10 µL，Cas12a的浓度为200 nM-500 nM，crRNA的浓度为300nM-750 nM，富G序列的浓度为150 nM-750 nM，ThT浓度为8.0 μM-25.0 μM；

所述步骤5）中的孵育温度为37°C，缓冲条件包含10-100 mM Na⁺或K⁺，pH 7.0-8.5；富G序列在该条件下形成G四联体结构；

用于形成G四联体的富G序列为：GGGAAGGGAGGGATGGGA。

2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3）中设计LAMP引物具体为：针对副溶血弧菌的Tlh基因合成LAMP引物，所述LAMP引物包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2。

3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3）中设计crRNA具体为：

根据LAMP的靶标序列以及PAM序列选定crRNA的识别序列为TGTTCTACACCAACACGTCGCAAA；

然后根据碱基互补配对的原则设计并合成对应的crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGACGUGUUGGUGUAGAACA。

4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤4）中：

LAMP体系包括2 μL模板DNA、1.6 μM内引物1和内引物2、0.2 μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4 mM dNTPs、8 U Bst DNA Polymerase Large Fragment和1×NEBuffer2.1；

扩增条件为：65°C孵育60 min。