[发明专利]一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用

说明书

本发明一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用。本发明通过将FITC通过化学修饰或物理吸附方式结合于待测表面，并设立标准pH对照，可通过荧光强度比率测定待测表面pH，该方法可用于测定细胞微环境pH，从而对细胞微环境特征进行定量分析。采用FITC作为荧光探针，获取简单，成本低；且本发明可对特定细胞微环境pH进行测定，实现对细胞微环境的定量分析。

技术领域

本发明属于生物技术方法领域，具体涉及一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用。

背景技术

FITC(异硫氰酸荧光素)是一种被广泛使用的荧光素，在生物技术领域，常用于对二抗的荧光标记，从而实现对蛋白的示踪，其主要原理是利用FITC上的N＝C＝S基团和蛋白质上游离的-NH2发生化学反应，而后在特定波长光源的激发下即可观测到荧光信号。

pH测定试剂已经得到了十分广泛的研发和应用，其主要方式为利用不同pH标准品建立pH测定试剂在荧光、吸光度、特定反应等方面的标准曲线，并测定待测物在该指标的数值，通过标准曲线确定待测物pH。

细胞微环境是影响细胞生长分化的重要因素，其中pH在细胞调控中十分重要，对于细胞微环境的pH目前已有有种估计方法，但目前尚缺乏一种精确的测定方法。

目前对FITC的应用主要限于荧光示踪，而pH测定试剂的制备均存在操作门槛及流程复杂性。申请号为CN201310685086.1的专利公布了一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，使用FITC标记精子，从而实现示踪效果，其应用仅限于FITC的荧光属性，未探讨从不同环境因素影响FITC荧光从而实现新应用。申请号为CN201510880704.7的专利公开了一种光开关型测定溶液pH的探针方法，自行合成了一种用于pH测定的荧光探针，但合成步骤复杂，应用范围小。诸如此类的专利均未实现FITC性质的充分利用和对于细胞微环境的pH测定。因此需要一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，利用简单的FITC即可实现对细胞微环境pH的定量分析。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出了一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用。通过将FITC结合于待测表面，通过荧光强度比率测定待测表面pH，该方法可用于测定细胞微环境pH，从而对细胞微环境特征进行定量分析。

一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，该方法具体为：通过将FITC通过化学修饰或物理吸附方式结合于待测表面，所述化学修饰为FITC的N＝C＝S基团和待测表面氨基的共价键形成，所述物理吸附方式为通过电荷作用实现FITC在待测表面的结合，并设立标准pH对照，通过荧光强度比率测定待测表面特定区域pH。

作为优选，所述标准pH对照选择pH已知的缓冲液。

作为优选，所述荧光强度测定方式为通过荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜测定。

作为优选，所述标准pH对照采用pH已知的PBS缓冲液。

本发明相比现有pH测定方式，本发明显著的进步在于：

1)采用FITC作为荧光探针，获取简单，成本低。

2)可对特定细胞微环境pH进行测定，实现对细胞微环境的定量分析。

因此，基于FITC的细胞微环境pH测定方法十分简便易行，并且获得pH数值准确，具有显著原创性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供以下附图进行说明：

图1FITC溶液在不同pH下的荧光比较。

图2FITC荧光强度与pH的标准曲线。

图3pH引起FITC荧光改变的组织学验证。