[发明专利]一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用

说明书

本发明公开了一种蜂毒素‑死亡素杂合肽突变体MTM及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种蜂毒素‑死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。本发明首次利用枯草芽孢杆菌基因修饰的SamyX‑6His‑EDDIE‑MTM融合片段构建了高效的重组枯草芽孢杆菌BSMW表达系统，用于MTM的生物合成。从1L发酵上清液中可获得高达254.38mg的MTM。纯化的MTM的大小与预期分子量3.2kDa一致。MTM具有对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用。

背景技术

抗生素滥用导致的耐药性问题日益严重，寻找全新类型的替代药物是解决耐药性问题的关键。抗菌肽以其独特的优势有望成为抗生素的理想替代品，但抗菌肽的来源问题一直是其开发应用的瓶颈。基因工程技术的快速发展一定程度上促进了抗菌肽的研究和开发。但与传统的抗生素相比，抗菌肽在抑杀活性、稳定性、细胞毒性等方面存在短板，研究者需进一步探究抗菌肽的抗菌机理及构效关系，对已有抗菌肽进行结构改造或设计新抗菌肽分子，从而在保证抗菌肽来源的前提下最大限度提高抗菌肽的实际使用价值。

通常抗菌肽的获取途径有三种：从生物体提取；通过化学合成的方法获得；采用基因工程表达技术得到目标抗菌肽。但是天然抗菌肽是生物机体在外界因素诱导下产生的活性物质，在生物体内含量较低，因此从生物体直接提取效率较低，而且提取难度也很大，步骤烦琐，不易标准化生产，成本较高，难以保证提取物的纯度，很难实现规模化生产，而且对某些高等动植物及人类采用此种方法并不现实。随着多肽合成技术的不断提高，人工合成具有生物活性的肽类物质得以实现并快速发展。通常天然抗菌肽的相对分子质量较小，因此采用化学合成方法可以获得具有生物学活性的天然抗菌肽，但化学合成对技术要求严格，合成时间较长，而且价格昂贵成本高，难以实现大规模生产。现代基因工程技术的飞速发展为大规模生产抗菌肽提供了有效途径，弥补了上述两种获取方法的不足，是一种经济有效的获得抗菌肽的方法。

蜂毒肽(melittin)又叫蜂毒素，是蜂毒的主要活性成分，占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要发挥作用的物质。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗辐射，最近又有对其抗癌作用进行研究的报道。蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，但它还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。蜂毒肽具有破坏细胞膜、致死细胞的特性，因此要从原核和真核表达系统获得有活性的蜂毒肽，需要以融合蛋白形式表达。

死亡素(Thanatin)是从半翅目昆虫刺肩蝽(Podisus maculiventris)血淋巴中分离的具有广谱抗菌活性的昆虫抗菌肽，也是第一个生理浓度时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌有抑制活性的抗菌肽。该肽具有杀细菌和杀真菌作用，具有迄今观察到的昆虫防御肽中最大的抗菌谱之一。

因此，提供一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM，其氨基酸序列如下：GIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM；SEQ ID NO.4。

进一步，所述的一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。

进一步，含有所述的蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM的重组枯草芽孢杆菌BSMW的构建方法，具体步骤如下：

(1)将SamyX-6His-EDDIE-MTM与pDM030载体通过酶切连接，获得重组质粒pDM045；所述SamyX-6His-EDDIE-MTM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；