[发明专利]一种二代测序方法和文库构建方法

权利要求书

1.一种二代测序方法，其特征在于：包括以下步骤，

转座子制备步骤，包括将测序接头包埋进Tn5转座酶中，形成Tn5转座子；

DNA样本处理步骤，包括采用所述Tn5转座子对待测DNA样本进行处理，仅仅通过一步处理，即获得片段化、末端修复和接头连接的片段化DNA样本；

Tn5酶促反应终止步骤，包括将终止反应液加入所述DNA样本处理步骤的反应产物中，终止Tn5酶促反应；

PCR扩增步骤，包括采用带有双端barcode的引物组，对所述Tn5酶促反应终止步骤的产物进行PCR扩增，获得双端barcode标记的待测DNA样本；其中，所述引物组能够特异性的对连接有接头的片段化DNA样本进行PCR扩增；

测序文库制备步骤，包括对PCR扩增产物进行纯化，获得纯化产物，将其作为待测DNA样本的测序文库；

测序步骤，包括采用测序平台对所述测序文库获取步骤获得的待测DNA样本的测序文库进行测序，获得测序数据；

测序下机数据处理步骤，包括使用转录本组装软件和转录本丰度评估软件，对测序下机数据进行序列组装和组装片段的丰度评估，获得测序结果。

2.根据权利要求1所述的二代测序方法，其特征在于：所述测序下机数据处理步骤，还包括根据丰度评估和长度判定目标序列，用待测DNA样本的reads比对目标序列，获得单个碱基的覆盖度和质量值；所述测序结果包括组装片段和组装片段的丰度，以及目标片段的比对文件和相应的文档说明。

3.根据权利要求1所述的二代测序方法，其特征在于：所述测序下机数据处理步骤，还包括先对测序下机数据进行过滤，保留高质量reads；根据双端barcode序列，对保留的高质量reads，拆分barcode，得到每个待测DNA样本的reads；然后再对每个待测DNA样本进行序列组装和丰度评估。

4.根据权利要求1-3任一项所述的二代测序方法，其特征在于：所述测序下机数据处理步骤中，所述转录本组装软件为Trinity、SOAPdenovo-Trans、bridger和MEGAHIT中的至少一种，所述转录本丰度评估软件为RSEM或Salmon。

5.根据权利要求1-3任一项所述的二代测序方法，其特征在于：所述测序文库制备步骤，还包括对PCR扩增产物的纯化产物进行环化，获得环化DNA，采用环化DNA制备DNA纳米球，将DNA纳米球作为待测DNA样本的测序文库。

6.根据权利要求5所述的二代测序方法，其特征在于：所述获得环化DNA，包括对环化反应的产物进行消化处理，消化处理完成后，采用磁珠纯化，获得环化DNA。

7.根据权利要求1-3任一项所述的二代测序方法，其特征在于：所述测序文库制备步骤中，对PCR扩增产物进行纯化采用磁珠纯化。

8.一种文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤，

转座子制备步骤，包括将测序接头包埋进Tn5转座酶中，形成Tn5转座子；

DNA样本处理步骤，包括采用所述Tn5转座子对待测DNA样本进行处理，仅仅通过一步处理，即可获得片段化、末端修复和接头连接的片段化DNA样本；

Tn5酶促反应终止步骤，包括将终止反应液加入所述DNA样本处理步骤的反应产物中，终止Tn5酶促反应；

PCR扩增步骤，包括采用带有双端barcode的引物组，对所述Tn5酶促反应终止步骤的产物进行PCR扩增，获得双端barcode标记的待测DNA样本；其中，所述引物组能够特异性的对连接有接头的片段化DNA样本进行PCR扩增；

测序文库制备步骤，包括对PCR扩增产物进行纯化，获得纯化产物，将其作为待测DNA样本的测序文库。

9.根据权利要求8所述的文库构建方法，其特征在于：所述测序文库制备步骤，还包括对PCR扩增产物的纯化产物进行环化，获得环化DNA，采用环化DNA制备DNA纳米球，将DNA纳米球作为待测DNA样本的测序文库。

10.根据权利要求9所述的文库构建方法，其特征在于：所述获得环化DNA，包括对环化反应的产物进行消化处理，消化处理完成后，采用磁珠纯化，获得环化DNA；

所述测序文库制备步骤中，对PCR扩增产物进行纯化采用磁珠纯化。