[发明专利]一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法

权利要求书

1.一种多克隆抗体在制备用于检测畜类怀孕早期药物上的应用。

2.一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，引物设计与合成；

步骤二，重组质粒的构建；

步骤三，EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；

步骤四，EPF重组蛋白表达条件优化；

步骤五，多克隆抗体的制备及鉴定。

3.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述引物设计与合成，包括：

利用软件Prime premier5设计引物，两端选择Sac1和Xho1酶切位点，引物大小为309bp；

所述引物序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述重组质粒的构建，包括：

(1)目的基因扩增

使用Trizol法从牦牛胎盘组织中提取RNA后按反转录试剂盒步骤反转录为cDAN，以cDAN为扩增模板扩增EPF目的基因；

(2)重组质粒构建

使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增出的EPF基因回收，并将该目的产物和载体pET28-His10-Sumo分别用SacI内切酶和XhoI内切酶于37℃水浴酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收；将回收后的目的产物，空载体，T4DNA连接酶体系用封口膜封口于16℃连接过夜；连接产物转化至DH5α感受态细胞中：将4ul产物加入50ul感受态中冰浴30min，42℃热激90s，迅速放入碎冰冰浴2min，加入400ul LB于37℃摇床培养1h，取50ul涂在含卡那的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养；使用QIAprep Spin Miniprep Kit 50提质粒，并进行重组质粒菌液PCR鉴定和测序验证。

5.如权利要求4所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，总体系为25ul：上下游引物各1ul，模板1ul，1-5TM2X High-Fidelity Master Mix12.5ul，用高压后的去离子水补至25ul；

PCR反应程序为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火55℃，15s，延伸72℃，30s，循环数为34，重延伸72℃，5min，4℃保存。

6.如权利要求4所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切体系为：10X CutSmart Buffer 4ul，SacI和XhoI各1ul，目的产物/载体8ul，26ul的dd水；

连接体系为：10X T4 DNA ligase Buffer 1ul，T4 DNA ligase 1ul，目的片段6ul，载体2ul。

7.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定，包括：

将阳性质粒转化至BL21即DE3感受态细胞中；涂板培养后挑取单克隆于37℃震荡培养13～16h收集于4℃冰箱保存备用；将保存的EPF重组菌液按1：200接种于37℃震荡培养，2～3h后加入IPTG过夜诱导，次日收集菌液，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理后取部分菌液进行SDS-PAGE电泳；剩余菌液离心，分别收集上清和包涵体进行Western Blot实验。