[发明专利]一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法

权利要求书

1.一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、取样，DNA提取与测序，以锦绣杜鹃为实验材料，采集其新鲜的叶子，使用改良的CTAB方法提取总基因组DNA，通过250bp的双末端测序对锦绣杜鹃的叶绿体全基因组进行测序并获得相应数据；

S2、叶绿体基因组组装，通过NOVOPlasty程序将读取的片段重新组装成完整的叶绿体基因组；

S3、叶绿体基因组注释，以杜鹃花科物种的基因组为参考，注释序列并检查注释结果，生成基因组的物理图谱用于识别重复序列；

S4、叶绿体基因分析，分析完整叶绿体基因组的GC含量和编码序列(CDS)，进行简单序列重复(SSR)和长重复筛查，碱基变异如果导致氨基酸的改变，为非同义突变，反之为同义突变；

S5、全基因组比较与分析，对叶绿体全基因组进行序列比对，将锦绣杜鹃的完整叶绿体全基因组与杜鹃花科已有叶绿体全基因序列信息的八个相关物种进行比较；

S6、系统进化分析，从NCBI的数据库中获得杜鹃花科已有的八个物种的叶绿体全基因组序列信息：

第一步，使用MAFFT进行序列比对分析；

第二步，用BioEdit软件进行序列比对与分析；

第三步，以猕猴桃和中华猕猴桃作为外群，利用RAxML中的GTRGAMMA模型构建系统进化树。

2.根据权利要求1所述的一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：步骤S1中的所述获得相应数据包括包括1228万条产物，锦绣杜鹃叶绿体全基因组的长度为136,249bp，由于缺乏反向重复序列，它没有典型的四分结构的；锦绣杜鹃叶绿体全基因组的总GC含量为35.98％，共注释到73个基因，包括2个rRNA基因，29个tRNA基因和42个蛋白质编码基因，密码子使用频率分析结果，所有基因共由8693个密码子组成，编码68种氨基酸，其中亮氨酸(Leu)是最常用的氨基酸(数量为948，占10.90％)，半胱氨酸(Cys)最少，丰富(76个，0.87％)，密码子的偏好性(RSCU)1，锦绣杜鹃叶绿体全基因组中的密码子更偏向以A或U结尾。

3.根据权利要求1所述的一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：步骤S3中所述锦绣杜鹃叶绿体基因组中注释到的基因中，有七个基因具有内含子，两个是蛋白质编码基因，五个是tRNA，六个基因仅有一个内含子，包括一个蛋白质编码基因ndhA和五个tRNA基因trnV-UAC，trnL-UAA，trnA-UGC，trnI-GAU和trnG-UCC，蛋白质编码基因(ycf3)包含两个内含子，ycf3的内含子序列最长(711bp+743bp)，trnL-UAA的内含子最小(504bp)。

4.根据权利要求1所述的一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：步骤S4中的所述的同义和非同义的分析：首先检测锦绣杜鹃叶绿体基因是否存在进行选择，需要估算同义(Ks)和非同义(Ka)突变率，然后将Ka/Ks比值进行分类，Ka/Ks1，Ka/Ks＝1，Ka/Ks1分别表示密码子替代表现为纯化，中性和正向选择。

5.根据权利要求1所述的一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：步骤S4中所述非同义突变一般受到自然选择的作用，非同义突变率(Ka)和同义突变率(Ks)的比值则说明受到何种选择作用，比值大于1，说明受到正选择效应，小于1，说明有纯化选择作用；使用mafft软件进行基因序列的比对(Katoh et al.2005)，使用KaKs_Calculator软件计算基因的Ka/Ks值。

6.根据权利要求1所述的一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：步骤S5中的所述八个相关物种分属于两个属，包括越橘属和水晶兰属。

7.根据权利要求1所述的一种基于叶绿体基因组测序的杜鹃花科植物分析方法，其特征在于：所述杜鹃花科植物在从完全自养到完全异养的转化过程中，发生纯化选择的迹象，rpl32是此转化中唯一被注释到的基因，它存在于四个异养物种中，其余两个异养物种中没有注释到rpl32基因。