[发明专利]CD4+ T细胞系在慢病毒感染滴度检测中的用途及方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及CD4+T细胞系在慢病毒感染滴度检测中的用途及方法，所述CD4+T细胞系包括MT4细胞、C8166细胞或Jurkat细胞，所述Jurkat选自Jurkat‑E6细胞。本发明慢病毒感染滴度的检测方法包括如下步骤：将待测慢病毒接种到CD4+T细胞系的细胞悬液中，继续培养CD4+T细胞系，培养结束后检测所述待测慢病毒的感染滴度。本发明中使用的MT4等血液来源的CD4+白血病T细胞系对慢病毒感染的敏感性显著高于293T细胞系，其中MT4细胞系对同一慢病毒载体感染滴度的检测值比293T细胞系高5‑10倍，即更接近于待测慢病毒的真实感染滴度，可以用作精确测量慢病毒感染滴度的检测细胞系。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及CD4+ T细胞系在慢病毒感染滴度检测中的用途及方法。

背景技术

重组慢病毒(Lentivirus)基因治疗载体是目前应用最为广泛的基因治疗载体之一，大多数重组慢病毒是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展而来。具有广泛的宿主范围、极低的免疫原性和优异的感染效率，能够有效的将目的基因的表达框架整合到包括分裂期及非分裂期细胞的基因组中。基于HIV的复制缺陷型的自我失活型，以VSVG为膜蛋白的第三代假包膜慢病毒载体能够有效的将目的基因的表达框架整合到包括分裂期及非分裂期的广泛的细胞基因组中，并且不受到细胞分裂影响的高效表达目的基因，使得以慢病毒为载体的基因治疗药物在临床上有可能达到一次治疗、终身有效的目标。目前已经被成功应用到多个上市基因及细胞治疗药物和临床在研基因治疗药物中，具有极大的商业化价值。

慢病毒载体将目的基因的表达框架整合到目的细胞基因组中是其持续终身高效表达目的基因的前提条件。将目的基因的表达框架拷贝整合到人体内细胞基因组中是慢病毒载体基因治疗药物给药的最终目的，即整合到细胞基因组中的目的拷贝数，即为慢病毒载体基因治疗药物的真实有效剂量。

理想的基因治疗药物给药应该达到目的基因在目的细胞群体中整合正好符合给药剂量的拷贝数。所有药物研究中药物的剂量不仅与药效相关，更与药物带来的毒性及安全性息息相关，剂量是药物应用中最为重要的指标，整合的基因表达框架拷贝数是基因治疗药物研发中必须要精确控制的剂量相关指标。事实上，慢病毒载体基因治疗药物为一次应用即整合进细胞基因组，药物相关毒性及安全性将不可逆的持续终身。药物剂量，即目的基因拷贝数控制的重要性，更远胜于常规药物的代谢途径。

要达到在目的细胞群体中整合正好符合给药剂量的目的基因拷贝数，就必须对慢病毒载体的生物学活性，即感染滴度进行准确的测量及检测。在各种离体及在体基因治疗应用中，慢病毒载体的粗制品、半成品、中间产物、洗脱物质、原料药、终产品制剂等均以感染滴度检测为指导慢病毒载体各种层次应用的第一重要指标。

绝大部分商业化的慢病毒基因治疗载体采用具有广泛宿主范围的VSV-G包膜，慢病毒载体感染滴度检测当前的主流方法是以培养的贴壁293T细胞为目的细胞的感染滴度检测方法，包括预先接种293T细胞；待细胞贴壁完成后以待测慢病毒载体样本感染贴壁后293T细胞；通过检测一段时间后293T细胞内整合进细胞基因组的目的基因拷贝数与细胞内源性基因拷贝数的比值，推算出该慢病毒载体的感染滴度。但接种贴壁293T细胞的慢病毒载体感染滴度检测方法有如下的一些缺陷：

1)感染滴度检测过程中，慢病毒颗粒与细胞的非培养表面相互作用，但是并不能与培养表面相互作用，减少了病毒感染细胞的几率，影响了慢病毒载体感染滴度的准确测量。

2)预先接种贴壁的293T细胞在贴壁的过程中伴随着细胞的增殖，感染发生时的精确细胞数量，较难以通过常规的悬浮细胞技术方法准确控制。

3)细胞在贴壁的过程增加了慢病毒载体感染滴度检测的操作周期。

4)HIV-1病毒在体内主要感染血液中的CD4+ T细胞，虽然采用VSV-G包膜的慢病毒基因治疗载体具有广泛的宿主范围，但293T细胞来源于人胚胎肾上皮细胞，并非特异HIV病毒感染的宿主细胞，所以有可能不是对慢病毒基因治疗载体感染最敏感的细胞系之一。