[发明专利]一种基于金纳米团簇/MnO2

权利要求书

1.一种用于检测前列腺抗原PSA和Let-7a miRNA的基于金纳米团簇/MnO₂纳米花的电化学发光传感器，由下列步骤组成：

步骤1. 蛋氨酸-金纳米团簇Met-Au NCs的制备：

将40 mL蛋氨酸和6 mL NaOH混合后添加到4 mL 20 mg/mL HAuCl₄溶液中，并以400 rpm进行充分搅拌；上述反应在37 °C下持续6小时，得到Met-AuNCs溶液；

步骤2. MnO₂纳米花的合成：

首先，将1.0 g KMnO₄和0.4 g MnSO₄与30 mL去离子水充分搅拌溶解30分钟，然后在50mL不锈钢高压釜中，140 ℃下反应1小时，缓慢冷却至室温；取出离心，并用乙醇和水分别连续洗涤三次，最后将洗涤纯化后的产物在60 ℃的真空烘箱中进行干燥，得到MnO₂纳米花固体；

步骤3. Au-MnO₂纳米花与二抗Ab₂的结合：

将50 mg上述制备的MnO₂纳米花固体加到含有50 mL去离子水的三口烧瓶中，然后将140mg 聚乙烯吡咯烷酮PVP和1 mL 1 wt％柠檬酸钠水溶液加入，并在剧烈搅拌下加热至沸腾；随后，80 μL 200 mM AuCl₄^-缓慢加入到上述沸腾的溶液中并煮沸30分钟；离心，得到的MnO₂-Au沉淀，使用乙醇、去离子水洗涤三次，然后在60 ℃下烘干，得到MnO₂-Au纳米花粉末；取0.2 mg MnO₂-Au 纳米花粉末加入到100 μL的PBS中混匀，随后加入50 μL的200 μg/mLAb₂溶液并在4 ℃下搅拌过夜，使用50 μL 1%的牛血清蛋白在4 ℃下反应1小时来封闭非特异性的识别位点，离心分离并洗涤以去除未结合的牛血清蛋白，最后所得的Ab₂-MnO₂-Au纳米花分散在100 μL的0.1 M, pH 7.4的PBS中；

步骤4. 基于滚环放大反应RCA及碱性磷酸酶ALP催化L-抗坏血酸-2-磷酸三钠AAP原位产生抗坏血酸AA: 2 μL环模板，序列为： P-CTACTACCTCATTTCCCGGTACCCACCCAGTCCACCCCCACATTTTAACTATACAAC、6 μL不同浓度的靶let-7a，序列为： UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU、120U T4 DNA和3 μL 10×T4 DNA buffer充分混合并在37 ℃恒温振荡器中反应1 h，随后加入5 μL dNTPs 10 mmol、3 U phi29 DNA聚合酶和3 μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，37 ℃的恒温振荡器中反应3 h以上，最后在75 ℃中孵育20分钟灭活；上述滚环放大的产物与6 μL CdSe-DNA探针，DNA序列为：TACCCACCCAGTCCACCCCCACATGCCCCTTATCCAGCCT-NH2和6 μLBiotin-DNA探针，序列为： AACTATACAACCTACTACCTCAGGAACTCTCTAATCGCTAACCC-biotin 在37 ℃下杂交1小时，随后加入10 μL 1:100的ALP-Streptavidin链霉亲合素溶液在37 ℃下孵育1小时，再将上述溶液离心并重新分散至30 μL；为进行酶促反应：将30 μL 4 mmol AAP溶液与上述溶液混合，并在避光处于37 °C反应 30分钟获得AA；

步骤5. 电化学发光ECL免疫传感器的制备：将10 μL纯化的AuNCs修饰在预处理的玻碳电极上，并在黑暗中干燥；然后，将10 μL 0.026 mol/L的3，4-噻吩二羧酸、10 μL的200 µg/mL一抗Ab₁溶液，依次滴加到电极表面，并在4 ℃孵育1.5小时；然后加入10 μL不同浓度的前列腺抗原PSA，4 ℃下孵育2小时，再与10 µL Ab₂-Au-MnO₂纳米花ECL信号淬灭探针形成免疫复合物，构建了ECL免疫传感器，检测ECL“off”信号；再固定PSA抗原浓度为10 ng mL^-1，将检测ECL之后的电极插入不同浓度Let-7a miRNA引发扩增反应产生的AA溶液中，反应4分钟，MnO₂被AA还原为Mn²⁺，成功构建 ECL“on”的传感平台，用于 Let-7a miRNA检测；

步骤 6 电化学发光检测：

利用 MPI-E 电化学发光仪器，在含有50 mM三乙胺 pH 7.4的0.1 M缓冲溶液中进行ECL检测，电位扫描范围是0.4 V~1.0 V，光电倍增管 PMT是900 V。