[发明专利]一种基于表面多刺编码微球的外泌体捕获方法

说明书

本发明公开了一种基于表面多刺编码微球的外泌体捕获方法，该方法采用的硅酸盐胶体晶体微球具有鲜艳的结构色，编码稳定，因其独特的表面带刺结构，比表面积大大提升，可偶联更多的抗体探针，比起常规的光子晶体微球用于检测具有更高的灵敏度，由于自身的结构特性可以吸附外泌体，具有极高的外泌体捕获率。

技术领域

本发明涉及一种基于表面带刺结构的硅酸盐胶体晶体微球以及以这种微球作为编码载体进行外泌体捕获的方法，属于生物医学研究，临床检测领域。

背景技术

近年来，多重分析和高通量测定引起了极大的研究兴趣，这对于疾病诊断，基因表达，药物筛选等非常重要。其中一种成功的生物技术是悬浮阵列，它使用自编码的微载体作为检测元件，与传统的平面微阵列相比，悬浮微阵列具有更高灵敏的反应速度和更大的灵活性。许多编码微载体已被提出用于悬浮阵列，包括分段纳米棒，光学图案编码粒子，半导体量子点(QD)，荧光粒子和光子晶体。其中光子晶体颗粒在悬浮阵列因其出色的光学性能保持着巨大的潜力。但现有报道中的光子晶体表面平整单调，限制了可固定的探针数量，反应效率和灵敏度。

外泌体是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中。外泌体膜为类似于细胞膜的脂质双分子层，不同类型细胞分泌的外泌体具有很多的共性，包括膜上富含脂类及丰富的跨膜蛋白，如四次跨膜蛋白家族成员的CD63、CD81等，以及膜内包含的各种RNA。外泌体携带有大量的蛋白质、脂质、短肽链、DNA、RNA、miRNA、环状RNA等生物活性分子，在细胞外环境中以非常稳定的方式存在，内容物成分与其分泌细胞的组织来源以及分泌细胞的病理生理状态密切相关。作为细胞间转运载体，与靶细胞通过膜融合或者内吞作用将内含生物活性物质转运至靶细胞，从而影响靶细胞的功能，调节靶细胞的代谢，参与免疫应答、炎症反应、细胞通讯、细胞凋亡、细胞迁移、血管生成和肿瘤细胞生长等重要病理生理过程，实现远距离信息传递、调控的功能。现阶段的外泌体捕获技术往往存在很多问题，提出的外泌体纯度不高，且步骤繁琐。基于仿花粉结构的表面带刺微球，由于其自身的结构优势可以有效捕获外泌体，通过偶联特异性的探针，还可实现多路筛选。

发明内容

本发明在于提出本发明涉及一种基于表面带刺结构的硅酸盐晶体反结构微球以及以这种微球作为编码载体进行外泌体捕获的方法，具有良好的应用前景。

为了解决现有的光子晶体微球用于外泌体捕获效率较低的问题，本发明提供的技术方案是：表面带刺结构的硅酸盐微球用于外泌体捕获的方法，包括以下步骤：

(1)抗体探针的偶联：

为偶联抗体探针，将带刺微球用APTES的酒精溶液浸泡若干小时，再用丁二酸酐溶液浸泡过夜，然后在MES缓冲液体系中，使用EDC和NHS活化羧基，浸泡8-15分钟；用PBS缓冲液洗涤后，将带刺微球与抗体探针在37℃下反应过夜；最后，在恒温摇床中，在37℃下，用BSA封闭带刺微球表面上未反应的羧基，然后用靶标外泌体的抗体修饰不同颜色的编码带刺微球；

(2)癌细胞来源外泌体的捕获：

将制备的抗体修饰的编码带刺微球与恒定温度的摇床中与经超速离心提纯后的外泌体PBS溶液在37℃下孵育过夜；孵育后，将捕获到外泌体的编码带刺微球用PBS缓冲液洗涤，然后在37℃下使用钙黄绿素进行外泌体荧光染色；最后，用PBS缓冲液彻底冲洗掉多余的钙黄绿素，并通过连接计算机的光谱仪和荧光显微镜读取和记录带刺微球的荧光强度。

步骤(1)所述的APTES酒精溶液配比为5％v/v，丁二酸酐溶液中配比为丁二酸酐/DMSO溶液1mg/mL。

步骤(2)所述的超速离心提纯前应使用0.22微米超滤膜过滤细胞培养上清液，离心转速为100000rpm。

为使钙黄绿素更容易进入细胞，步骤(2)所述的钙黄绿素为AM修饰的钙黄绿素，荧光为绿色荧光，由蓝光激发。