[发明专利]一种新型组织单细胞空间转录组技术

说明书

本发明提供了一种单细胞空间转录组分析方法。具体地，本发明提供了一种可以检测非解离状态的单细胞空间转录组。本发明的方法可以在保有组织中细胞空间位置信息的基础上，高通量地收集单细胞，通过二代高通量测序，获得高灵敏度、高重复性和可定量化的细胞转录组数据，并基于每个目标细胞的三维坐标值，将每个目标细胞的单细胞空间转录组测序数据映射于组织样品的对应空间上，从而获得组织样品的单细胞空间转录组测序数据集。本发明的方法可广泛应用于正常和疾病组织的单细胞基因表达定量研究，为组织中细胞状态和功能研究提供更高效和准确的工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测非解离状态细胞的单细胞空间转录组技术。

背景技术

对正常和疾病组织中的细胞进行基因表达的定量测量和研究，是理解正常组织功能和疾病组织异常的关键信息。近年来单细胞转录组技术的快速发展和应用，已经突破传统转录组技术只能获得大量细胞平均基因表达信息的局限，提供了解析单个细胞基因表达谱的能力，使得在单细胞分辨率进一步解析各种生物学问题成为可能。多种单细胞转录组文库构建方法层出不穷，大大提高了单细胞转录组测序技术的通量，灵敏度和准确性，使其在发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥着越来越重要的作用，成为生命科学研究的热点。

在多种单细胞转录组文库构建方法中，单细胞RNA条码测序方法(SCRB-seq，US14898030A1)由于检测灵敏度高，成本低廉，方法灵活性强等优点，吸引了研究者的兴趣。该方法基于中等通量的96/384孔板，采用细胞标签(Barcode)和转录本标签UMI(uniquemolecular identifier)的富集3'端建库策略。细胞Barcode的使用提高了单细胞放大的均一性和重复性，UMI的使用可以消除PCR扩增偏差，实现对转录本的定量分析。并且，该方法使用设备简单，适合在实验室推广。因此，这一方法在单细胞转录组分析中具有巨大的应用潜力。

目前用单细胞转录组技术(包括SCRB-seq技术)对组织中细胞进行基因表达分析，需要将组织酶解成单细胞悬液进行，如目前常用的流式细胞分选、口吸管法和微流控系统分离等技术，这导致细胞在组织中原本的空间位置信息丢失，从而无法将基因表达的结果与细胞的具体位置联系起来，而细胞的空间位置对于理解细胞的分化命运、细胞间的相互作用等具有重要意义。另一方面，较长时间的酶解消化过程，以及口吸管产生的环境压力等会对细胞产生强烈刺激，可能引起细胞产生应激反应，使转录组信息发生改变，甚至导致特异性细胞类型的RNA选择性降解，进而影响转录组信息的准确性。因此，基于组织原位的空间信息，对组织中的细胞进行基因表达测量，是理解细胞在组织真实微环境中行为和功能的关键，对于理解组织发育、疾病发生等具有重要意义。近年来，空间转录组学研究的重要性得到越来越多研究者的重视。

现有的空间转录组技术主要分为两类：一类是基于RNA荧光原位杂交杂交和成像的方法，如smFISH，MERFISH，seqFISH等；另一类是基于测序的方法，包括TIVA，ISS，FISSEQ，以及基于激光显微切割(Laser capture microdissection,LCM)的细胞转录组分析方法等。smFISH，seqFISH等方法在分析的细胞数量和检测靶点的数量上都很有限，并且需要大量的FISH探针，连续杂交过程也很耗时；而TIVA等基于测序的方法虽然可分析的细胞数量有提高，但转录本检测效率普遍较低。与上述方法相比，如果将激光显微切割技术和高通量的单细胞转录组测序技术相结合，既可以获得细胞的空间信息，又能同时获得大量基因表达的定量信息。

激光显微切割技术采用对核酸无损伤的激光精准捕获组织切片中的目标细胞，组织样品前处理时以液氮速冻代替酶消化解离，避免了传统单细胞分离时因较长时间酶解、机械压力等对细胞转录组造成的影响，因此可以最大程度地保留细胞原始的空间位置信息和真实的转录组信息。将获得的转录本信息最终对应回组织内原始位置，可以最大程度的还原组织内部各空间位置的基因表达状态。虽然将激光显微切割获得的样品用于大量细胞转录组测序已有很多报道，但是这些研究往往需要收集几十至数千个细胞。