[发明专利]四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用及构建方法

权利要求书

1.一种四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用，其特征在于，BSMV超表达载体在建立棉花亚细胞定位标记系的应用。

2.根据权利要求1所述的四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用，其特征在于，所述的BSMV超表达载体包括pCaBS-γ2:PM:GFP、pCaBS-γ2:MT:GFP、pCaBS-γ2:NU:GFP、pCaBS-γ2:ER:GFP、pCaBS-γ2:TP:GFP、pCaBS-γ2:PL:GFP、pCaBS-γ2:GB:GFP、pCaBS-γ2:PR:GFP;

四组分BSMV超表达载体的构建方法的步骤为：

S1，构建Ti瞬时表达载体

S11，棉花内源性基因的克隆：选择8个长度、大小不同、在不同细胞器的基因，分别为GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP，根据内源性基因序列设计其全长引物，含酶切位点KpnI和XbaI，进行PCR扩增；

S12，回收目的片段，将胶回收产物和T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；

S13，以验证成功的连接有目的片段的T载体为模板进行PCR扩增；

S14，将S13的PCR产物进行电泳并回收目的片段，将回收的PCR产物和含GFP基因的pCAMBIA-1300载体同时进行双酶切，反应条件为37℃水浴酶切3小时，将酶切产物进行纯化并回收目的片段和空载体，并将目的片段和空载体进行连接；

S15，将S14得到的连接产物进行大肠杆菌DH5α感受态转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒，对已测浓度的质粒进行双酶切验证，根据电泳结果判断酶切条带大小，将酶切验证正确的质粒进行测序，并于-80℃保存；

S16，农杆菌的转化和筛选：将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，并通过PCR结果挑选出验证正确的单克隆，在-80℃保存菌液，并将单克隆在新的YEB固体培养基上划线4℃留存，获得Ti瞬时表达载体；

S2，基于Ti瞬时表达载体，构建BSMV超表达载体

S21，内源性基因与GFP融合体的克隆：以S1构建好的瞬时表达载体为模板，以内源性基因及GFP融合片段为目的片段设计LIC引物，在前后引物的5’端分别加入AAGGAAGTTTAA及CGGGCC AGCCACCGCCACCAGT形成LIC引物；

S22，将PCR产物电泳并进行胶回收；

S23，pCaBS-γ2用ApaI单酶切使之线性化后并纯化回收；

S24，将S22、S23两个反应体系在22℃反应30 min后，75℃水浴20 min使酶失活，将10ng处理后的载体与100 ng处理后的目的片段涡旋混合均匀，加热至66℃反应2 min，然后室温放置10 min使混合液降至室温，加入1μL T4连接酶及1μL T4 buffer进行连接1 h，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α细胞中，通过菌落PCR筛选菌落，并通过测序验证是否正确插入；

S25，大肠杆菌DH5α转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒及酶切验证，获得BSMV超表达载体。

3.根据权利要求2所述的四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用，其特征在于，所述的步骤S11中GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP的正、反引物为：

GhPM-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGACTAAGGATATTGAGACCACGG

GhPM-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAAGCATTGCTCCTGAAAGATCCAAGG

GhMT-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCAGCTCGTAGAATCTCTTC

GhMT-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGACAACCATGCTGGATTCTTCAAAGG

GhNU-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGAACCACAACCCGCAATCC

GhNU-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAATTCCTCTCTAGAAGCGGGATCG

GhER-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGAAGAACACTGAAAGACTCGCC

GhER-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGA TACATCAAATCTCAATGCTAGGGC

GhTP-GFP的正向引物序列为：CGATGGATCCATGCCGATCAGAAACATAGCAG

GhTP-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAATAATCGGTGGTTGGGAGCTGCTCG

GhPL-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGAGGTTTTATCTTCTTCGTCTTC

GhPL-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGATGTACCAGATCCTATAAGTGTGTGG

GhGB-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGCGAGGAGTAGATCATCGTCAT

GhGB-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGACAGTAGTAGTATCCCAAGCAGGTAG

GhPR-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCGTTTCCAGTAGTCGATACCG

GhPR-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAACTTCATTCTTTTGCGGACCTCGT 。