[发明专利]新型冠状病毒肺炎重组人5型腺病毒疫苗

权利要求书

1.一种重组人5型腺病毒rAd-tPASopti6PB，其是在SARS-CoV-2的刺突蛋白SA的基础上将S蛋白基因信号肽替换为组织型纤溶酶原激活因子信号肽tPA，同时将F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P这6个位点氨基酸残基均突变为脯氨酸，再将SA蛋白基因2044-2055位碱基突变为“GGCTCCGCCTCC”，使得Furin裂解位点突变失活，获得改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S6PB)，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S6PB)由病毒载体编码，所述病毒载体为复制缺陷型人5型腺病毒rAd病毒株，构建了表达新型冠状病毒SA蛋白变体的S6PB基因的重组人5型腺病毒rAd-tPASopti6PB。

2.一种疫苗组合物，包含权利要求1所述的重组人5型腺病毒rAd-tPASopti6PB。

3.权利要求1所述重组人5型腺病毒rAd-tPASopti6PB的制备方法，其特征在于通过基因合成的方法合成SARS-CoV-2S蛋白突变体tPASopti6PB基因，并将其克隆至pBluescriptⅡ(+/-)的EcoRⅤ位点，命名为pBlue-tPASopti6PB，将组织型纤溶酶原激活因子的信号肽基因替代SARS-CoV-2S蛋白信号肽基因构成tPASopti6PB基因，同时在tPASopti6PB基因的起始密码子ATG前插入Kozak序列“GCCGCCACC”，tPASopti6PB基因是在SARS-CoV-2S蛋白基因按哺乳动物密码子偏嗜性进行优化的基础上，将该蛋白基因2449-2451位、2674-2676位、2695-2697位、2824-2826位、2956-2958位和2959-2961位碱基均突变为“CCC”，由此将上述碱基编码的第817位苯丙氨酸、第892位丙氨酸、第899位丙氨酸、第942位丙氨酸、第986位赖氨酸和第987位缬氨酸均突变为脯氨酸；将SARS-CoV-2S蛋白裂解位点基因2044-2055位碱基突变为“GGCTCCGCCTCC”，由此裂解位点氨基酸由“RRAR”突变为“GSAS”,根据tPASopti6PB蛋白基因序列和重组穿梭载体pShuttle-CMV中多克隆位点基因序列，设计了构建表达tPASopti6PB蛋白基因重组穿梭载体所用引物，

用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ酶切、线性化穿梭载体pShuttle-CMV，胶回收纯化线性化穿梭载体，采用PCR方法，以pBlue-tPASopti6PB为模板，用引物pShuttle-CMV-F和pShuttle-CMV-R扩增得到tPASopti6PB蛋白基因，胶回收纯化tPASopti6PB蛋白基因，用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ酶切tPASopti6PB蛋白基因，胶回收纯化tPASopti6PB蛋白基因，利用T4连接酶试剂盒将tPASopti6PB蛋白基因顺序克隆至穿梭载体pShuttle-CMV的KpnⅠ和XhoⅠ位点，构成含有tPASopti6PB蛋白基因的重组穿梭载体pShuttle-CMV-tPASopti6PB，将经限制性内切酶PmeⅠ线性化的重组穿梭载体pShuttle-CMV-tPASopti6PB质粒转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞，进行同源重组，在卡那霉素抗性的培养基上筛选，挑取单克隆，用PacⅠ酶切鉴定后，得到重组腺病毒载体pAdEasy-1-tPASopti6PB质粒，将经限制性内切酶PacⅠ线性化的重组质粒pAdEasy-1-tPASopti6PB进行质粒抽提，293A细胞接种于35mm六孔板中，待过夜生长至80％～90％单层时，将抽提的质粒pAdEasy-1-tPASopti6BP，采用脂质体转染的方法，按2μg每孔的剂量，转染293A细胞，待细胞出现圆缩病变后，收取细胞和上清，冻融三次，1：40、1:200和1:800稀释病毒液，接种293A细胞，5％CO₂、37℃温箱培养至72小时后，将细胞圆缩病变达80％的细胞提取基因组DNA进行PCR鉴定，经PCR鉴定正确后，表达tPASopti6PB蛋白基因的腺病毒命名为rAd-tPASopti6PB。