[发明专利]一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括：

第一溶液：为第一裂解液，由1.5ml吐温-100、0.91g三羟甲基氨基甲烷、1.31g氯化钠、6.5ml盐酸，加双蒸水至150ml刻度后制得PH7.5的混合液，于4℃保存；

第二溶液：为第一封闭试剂，采用1M TCEP阻燃剂,4℃保存；

第三溶液：为第二封闭试剂，采用0.5M NEM试剂,-20℃冻存；

第四溶液：为第二裂解液，采用1.5ml吐温-100、0.91g三羟甲基氨基甲烷、1.31g氯化钠、6.5ml盐酸、加双蒸水至150ml刻度后制得PH7.2的混合液，于4℃保存；

第五溶液：为羟胺反应缓冲液，采用1M HAM培养液,-20℃冻存；

第六溶液：为第三裂解液，采用1.5ml吐温-100、0.91g三羟甲基氨基甲烷、1.31g氯化钠、6.5ml盐酸，加双蒸水至150ml刻度后制得PH6.2的混合液，于4℃保存；

第七溶液：为第三封闭试剂，采用1M IAA吲哚-3-乙酸试剂,于-20℃冻存；

第八溶液：为生物素标记物，采用5mM Biotin-BMCC巯基反应的生物素交联剂，于-20℃冻存；

第九溶液：为HRP抗体，采用1mg/ml HRP辣根过氧化物酶，-20℃冻存。

2.如权利要求1所述的一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括IP-WB方法，具体包括如下步骤：

S01、不少于500ug的总蛋白与beads 4℃孵育过夜，冲洗缓冲液清洗后，加入582ul第一溶液、12ul第三溶液以及6ul 0.1M PMSF蛋白酶抑制剂，将总蛋白连同beads平分为两份，分别加入到两个滤管中，并分别标记为+HA1和-HA1，去掉滤管底部塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；盖紧底部塞子，加入196ul第一溶液以及4ul第三溶液，室温翻转30min，去掉滤管底部塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

S02、向每管加入500ul第四溶液，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

S03、重复步骤S02两次；

S04、盖紧滤管底部塞子，在所述-HA1管中加入500ul第四溶液，在所述+HA1管中加入400ul第四溶液和100ul第五溶液，室温翻转1h；去掉滤管底部塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

S05、每管加入500ul第六溶液，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

S06、重复步骤S05两次；

S07、盖紧滤管底部塞子，每管中加入500ul第六溶液和0.5ul第八溶液，室温翻转1h，去掉滤管底部塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

S08、每管加入500ul第一溶液，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

S09、重复步骤S08两次；

S10、去掉滤管底部塞子，把滤管放入新的1.5ml离心管中，每个滤管中加入煮沸的50ul2×蛋白缓冲液，低速震荡10分钟，掌上离心机离心，收集获得第一滤液，再加入煮沸的50ul2×蛋白缓冲液，低速震荡10分钟，掌上离心机离心，收集获得第二滤液；将第一滤液和第二滤液合并形成混合滤液，用于下游WB检测。

3.如权利要求2所述的一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述下游WB检测包括如下步骤：

P01：将混合滤液进行SDS-PAGE胶分离，并将蛋白转到PVDF膜上；

P02：用1×TBS缓冲液清洗膜2次，每次10min；

P03：用1×TBS-T洗涤缓冲液配制工作浓度3％BSA牛血清白蛋白，室温封闭PVDF膜1h；

P04：用1×TBS-T洗涤缓冲液清洗PVDF膜10min；

P05：用1×TBS-T洗涤缓冲液配制工作浓度3％BSA，按照稀释比例1:5000-1:10000加入Streptavidin-HRP抗体，4℃孵膜过夜；

P06：用1×TBS-T洗涤缓冲液清洗PVDF膜3次，每次10min；

P07：用化学发光仪曝光检测。

4.如权利要求1所述的一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括IP-MS方法，具体包括如下步骤：

T01：不少于500ug总蛋白与beads 4℃孵育过夜，冲洗缓冲液清洗后，加入435ul第一溶液、10ul第二溶液以及5ul 0.1M PMSF蛋白酶抑制剂，室温翻转30min，加入50ul第三溶液室温翻转2h；

T02：将蛋白连同beads平分为两份，分别加入到两个滤管中，并分别标记为+HA2和-HA2；去掉滤管底部红色塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

T03：每管加入500ul第四溶液，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

T04：重复步骤T03两次；

T05：盖紧滤管底部红色塞子，在-HA2管中加入500ul第四溶液，在+HA2管中加入400ul第四溶液和100ul第五溶液，室温翻转1h；去掉滤管底部红色塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

T06：每管加入500ul第六溶液，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

T07：重复步骤T06两次；

T08：盖紧滤管底部红色塞子，每管中加入480ul第六溶液和20ul第七溶液，避光室温翻转1h；去掉滤管底部红色塞子，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

T09：每管加入500ul第一溶液，掌上离心机轻甩，弃掉滤液；

T10：重复步骤T08两次；

T11：去掉滤管底部红色塞子，把滤管放入新的1.5ml离心管中，每个滤管中加入煮沸的100ul 2×蛋白缓冲液，低速震荡10分钟，掌上离心机离心，收集获得第三滤液；再加入煮沸的100ul 2×蛋白缓冲液，低速震荡10分钟，掌上离心机离心，收集获得第四滤液；将第三滤液和第四滤液合并形成混合滤液，低温送至MS检测中心检测。