[发明专利]一种酶的改良方法

权利要求书

1.一种酶的改良方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（一）获得高精度蛋白结构模型；

（二）根据高精度蛋白结构模型，同时筛选蛋白表面氨基酸突变位点以及活性区域的候选突变位点，包括如下步骤：

S1.根据酶的氨基酸保守性信息设计可能的氨基酸位点替换；

S2.根据共进化信息设计可能的氨基酸位点共进化的残基对替换；

S3.对S1和S2获得的突变体进行能量计算及聚类分析，筛选能量较低的突变体进行生物学验证，选择表现优良的突变体，完成一轮突变体筛选。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当步骤（二）中S1和S2获得的突变体数量较大时，进行2个、3个位点或多个位点的组合突变，在S3.步骤中，随机设计突变体组合，对获得的所有突变体进行聚类分析，计算所有突变体的能量，筛选每个聚类中能量最低的突变体进行生物学验证。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，完成一轮突变体筛选之后，挑选表现最优的突变位点，并将其作为下一轮的起始突变，将最优突变位点引入蛋白结构中，重复步骤（一）至（二），例如2-3次重复，直至获得若干理想的突变体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，挑选所述若干理想突变体，在这些突变体的基础上交叉叠加彼此的有益突变，获得新的突变体并进行生物学验证，直至获得最终的突变体。

5.如权利要求1-2，4之一所述的方法，所述氨基酸为表面氨基酸和/或酶活性区域的氨基酸。

6.如权利要求3所述的方法，所述氨基酸为表面氨基酸和/或酶活性区域的氨基酸。

7.如权利要求1-2，4，6之一所述的方法，所述步骤（一）包括如下方法：

S1.采用同源建模对目的蛋白进行结构模拟，选择能量最低的蛋白结构模型；

S2.通过深度学习预测蛋白结构的可靠性并进行优化，获得高精度蛋白结构模型。

8.如权利要求3所述的方法，所述步骤（一）包括如下方法：

S1.采用同源建模对目的蛋白进行结构模拟，选择能量最低的蛋白结构模型；

S2.通过深度学习预测蛋白结构的可靠性并进行优化，获得高精度蛋白结构模型。

9.如权利要求5所述的方法，所述步骤（一）包括如下方法：

S1.采用同源建模对目的蛋白进行结构模拟，选择能量最低的蛋白结构模型；

S2.通过深度学习预测蛋白结构的可靠性并进行优化，获得高精度蛋白结构模型。

10.一种细胞色素P450s酶的改良方法，其特征在于，包括如下步骤：

（一）获得高精度蛋白结构模型；

（二）获得突变体：

S1.利用位置特异性打分矩阵分析蛋白氨基酸保守性，根据保守性信息设计可能的氨基酸位点替换；

S2.利用氨基酸共进化分析平台获得蛋白氨基酸共进化信息，查找可能氨基酸位点共进化的残基对，根据氨基酸共进化分析平台显示的打分筛选对应残基对的替换；

S3.对位置特异性打分矩阵和氨基酸共进化分析平台获得的突变体进行能量计算,筛选突变后蛋白能量较低的突变体进行验证，选择表现优良的突变体。

11.如权利要求10所述的方法，所述氨基酸为表面氨基酸和/或酶活性区域的氨基酸。

12.如权利要求10或11所述的方法，所述步骤（一）包括如下方法：

S1.利用同源建模功能对酶进行结构模拟，获得最优结构；

S2.将血红素和底物对接到蛋白结构模型中，获得复合体结构；S3.进一步利用深度学习框架评估蛋白结构模型中每个残基的准确性和残基-残基距离中的符号错误，指导蛋白结构模型优化，提高蛋白结构模型的准确性，获得高精度的蛋白结构模型。

13.一种制备细胞色素P450s酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1基于权利要求1-9之一所述的方法，以黄瓜野生型P450s酶CPY87D20为初始酶，获得突变体V1，序列如SEQ.ID.No.2所示；

2将突变体V1的352位突变为I，获得突变体V2，序列如SEQ.ID.No.3所示；

3基于权利要求1-9之一所述的方法，在黄瓜野生型P450s酶CPY87D20为初始酶，获得突变体V3，序列如SEQ.ID.No.4所示；

4在突变体V2和V3的基础上，进一步突变为V2-I46L-A49L、 V3-C343Y，并进行生物学验证；

5通过将上述突变体中的有益突变进行组合获得最佳的突变体V4，其序列如SEQ.ID.No.5所示；

所述黄瓜野生型P450s酶CPY87D20的序列如SEQ.ID.No.1所示。