[发明专利]一种基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法

权利要求书

1.一种基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)表面活性剂溶液的配制：将表面活性剂溶解于Tris-HCl缓冲液中，超声25～35min混合均匀，得到浓度为0.01～1mM的表面活性剂溶液；

(2)乙酰胆碱酯酶标准溶液和乙酰胆碱酯酶抑制剂标准溶液的配制：将乙酰胆碱酯酶标准品和乙酰胆碱酯酶抑制剂标准品分别溶解于Tris-HCl缓冲液中，制得不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液和乙酰胆碱酯酶抑制剂标准溶液；

(3)乙酰胆碱酯酶标准曲线的测定：分别向步骤(2)制得的不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液中加入步骤(1)配制的表面活性剂溶液，在20～60℃下孵育25～55min，得到混合溶液a；然后用悬滴法向混合溶液a中缓慢注射油相，当油相全部悬滴时，开始记录悬滴时间直至油相掉落，根据悬滴时间和对应的乙酰胆碱酯酶标准溶液浓度的对数值，绘制标准曲线a；

(4)乙酰胆碱酯酶抑制剂标准曲线的测定：分别向步骤(2)制得的不同浓度的乙酰胆碱酯酶抑制剂标准溶液中加入步骤(2)配制的乙酰胆碱酯酶标准溶液，在20～60℃下孵育25～55min，孵育完成后继续加入步骤(1)配制的表面活性剂溶液，在20～60℃下孵育25～55min，得到混合溶液b；然后用悬滴法向混合溶液b中缓慢注射油相，当油相全部悬滴时，开始记录悬滴时间直至油相掉落，根据悬滴时间和对应的乙酰胆碱酯酶抑制剂标准溶液浓度的对数值，绘制标准曲线b；

(5)待测样品乙酰胆碱酯酶的测定：将待测乙酰胆碱酯酶溶解于Tris-HCl缓冲液中，得到待测样品乙酰胆碱酯酶溶液，按照步骤(3)所述的方法测定体系的悬滴时间，通过测定的悬滴时间对照标准曲线a计算得到待测样品中乙酰胆碱酯酶的含量；

待测样品乙酰胆碱酯酶抑制剂的测定：将待测样品乙酰胆碱酯酶抑制剂溶解于Tris-HCl缓冲液中，按照步骤(4)所述的方法测定体系的悬滴时间，通过测定的悬滴时间对照标准曲线b计算得到待测样品中乙酰胆碱酯酶抑制剂的含量。

2.如权利要求1所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十二烷基三甲基溴化钠、十四烷基三甲基溴化钠、十六烷基三甲基溴化钠、氯化甲酰胆碱、氯化乙酰胆碱或氯化十四酰胆碱。

3.如权利要求2所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，所述表面活性剂为氯化十四酰胆碱。

4.如权利要求1所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表面活性剂溶液的浓度为0.1～1mM。

5.如权利要求4所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，所述表面活性剂溶液的浓度为1mM。

6.如权利要求1所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙酰胆碱酯酶标准溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度为0.1～1000mU/mL，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂标准溶液中乙酰胆碱酯酶抑制剂的浓度为10～10000nM。

7.如权利要求6所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂为溴化新斯的明。

8.如权利要求1所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述乙酰胆碱酯酶标准溶液和表面活性剂溶液的体积比为1：1；所述油相和混合溶液a的体积比为1：(70～90)。

9.如权利要求1所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述的油相为密度与水接近的液体，油相密度为0.9～1.2g/cm³。

10.如权利要求9所述的基于悬滴法检测乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的方法，其特征在于，所述油相为液晶5CB。