[发明专利]一种截短的苦参异戊烯基转移酶及其应用

说明书

本发明公开了一种截短的苦参异戊烯基转移酶及其应用，属于生物工程领域。本发明在苦参来源的异戊烯基转移酶SfN8DT‑1的基础上对N端分别进行了不同位点的截短，构建了重组质粒pY26‑SfN8DT‑1以及7个截短后的异戊烯基转移酶突变体质粒。将重组质粒转入酿酒酵母后，得到了从头合成8‑异戊烯基柚皮素的酿酒酵母重组菌。其中重组酿酒酵母在YPD培养基中发酵120h后最高能够生产9.33mg/L 8‑异戊烯基柚皮素，相对于对照菌株PN01‑pY26‑SfN8DT‑1提高了290.10％，是目前报道的生物合成8‑异戊烯基柚皮素的最高产量。该策略为代谢工程改造酿酒酵母生产8‑异戊烯基柚皮素奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种截短的苦参异戊烯基转移酶及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

8-异戊烯基柚皮素(8-PrenyInaringenin，8-PN)是一种异戊烯基化的黄酮类化合物，主要存在于啤酒花和苦参等植物中，具有预防癌症、缓解女性更年期症状、预防骨质疏松症等功效。目前，8-异戊烯柚皮素的制备方法主要为植物提取法和化学合成法：1）植物提取法主要从废啤酒花中提取得到8-PN，但是啤酒花中8-PN的含量很低，每千克啤酒花球果只有0.025~0.060 g的8-PN，并且，啤酒花中同分异构体6-异戊烯基柚皮素的存在大大增加了8-PN的分离和纯化的难度；2）化学合成法目前是以柚皮素或异黄腐酚为底物，经过多步化学反应合成8-PN。但是化学合成法操作较为复杂、污染大、会给环境带来巨大的压力。

酿酒酵母能够在低pH条件下生长、营养需求简单、底物耐受性高，被广泛运用于工业生产，并且酿酒酵母是公认的安全的模式菌株。另外，酿酒酵母所具有的一些天然特性可能更加适合表达植物来源的基因。8-PN可以看作在柚皮素的C8位增加一个异戊烯基：二甲基丙烯基二磷酸-三铵盐(DMAPP)，在酿酒酵母中，其内源甲羟戊酸途径能够以乙酰辅酶A为前体高效的合成DMAPP，这表明利用酿酒酵母合成异戊烯基化的黄酮类化合物具有非常大的潜力。目前市场上，5 mg纯度为98%的8-PN的价格在2000元左右，而5 g纯度为98%的柚皮素价格在100元左右，二者价格相差巨大。因此，利用酿酒酵母生产8-PN具有极高的经济价值和技术可行性。

植物来源的异戊烯基转移酶属于UbiA超家族，主要存在于少数几种植物中，如：豆科、桑科和大麻科，其几乎在所有生物的细胞呼吸、光合作用、抗氧化作用中发挥着关键作用。大多数异戊烯基转移酶能催化芳香族底物的异戊烯基化，其中芳香族底物为异戊烯基受体，类异戊二烯类基团为异戊烯基供体。此外，大多数植物来源的异戊烯基转移酶往往具有不同的定位信号，导向不同的细胞器，如线粒体、内质网和叶绿体。这些应该被信号肽酶切割的信号序列在不同的宿主中可能无法被识别和切除，该定位信号序列有可能会干扰异戊烯基转移酶的结构和功能，因此，针对异戊烯基转移酶进行截短对提高其催化活性具有重要的意义。

发明内容

[技术问题]

现有技术中，8-异戊烯基柚皮素(8-PrenyInaringenin，8-PN)的产量较低，操作步骤复杂，不够绿色环保，亟需一种成本低廉，绿色环保，产量高且纯度高的8-PN生产方法。

[技术方案]

本发明的第一个目的是提供一种异戊烯基转移酶突变体，所述突变体以苦参来源的异戊烯基转移酶的氨基酸序列为基础，自N端发生了氨基酸的截短；所述苦参来源的异戊烯基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述截短是指截去N端的前59个，60个，61个，62个，81个，101个或110个氨基酸。

本发明的第二个目的是提供编码上述异戊烯基转移酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含有上述基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括pY26系列载体。