[发明专利]一种基于明胶水凝胶的几丁二糖脱乙酰酶固定化方法

说明书

本发明公开了一种基于明胶水凝胶的几丁二糖脱乙酰酶固定化方法，包括如下步骤：向含有几丁二糖脱乙酰酶的酶液中加入明胶，并加热使明胶溶解；加入京尼平，并按体积比1:0.8～1.2加入含有表面活性剂的氟化液，振荡混匀后冷却，并摇晃培养0.5～2天；按体积比，加入5～15％的1H,1H,2H,2H‑全氟辛醇，并加入缓冲液，水油分层后取水相，静置后获得第一水凝胶；第一水凝胶经清洗后，加入缓冲液，并加入京尼平，摇晃培养1～5天，得到第二水凝胶，即为固定化几丁二糖脱乙酰酶。本发明采用两步成胶的方式，制备得到的固定化几丁二糖脱乙酰酶，具有较好的耐高温性能，可以耐受80℃高温处理，对提升酶的催化活性具有显著帮助，并且稳定性较好，重复使用8次后，水凝胶催化活性无明显变化。

技术领域

本发明涉及一种基于明胶水凝胶的几丁二糖脱乙酰酶固定化方法，属于酶固定化技术领域。

背景技术

氨基葡萄糖是一种广泛存在于自然界的小分子单糖，在医药和保健品等领域有广泛的应用。目前，工业上生产氨基葡萄糖主要采用化学水解法，此方法以虾蟹壳中的甲壳素为底物，使用强酸进行水解，反应条件苛刻、易造成环境污染且生产效率有限。随着绿色化学、环保制造的提倡，更多的研究开始关注绿色环保的微生物发酵技术，并以甲壳素、葡萄糖等廉价产品为底物，通过水解或合成等方式生产氨基葡萄糖。其中，几丁二糖脱乙酰酶可以将相对廉价的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰水解，得到氨基葡萄糖。然而，几丁二糖脱乙酰酶的使用多为一次性使用，这造成了对酶的浪费，增加了工业化生产的成本。

固定化酶可以在反应之后进行回收，且固定后的酶在使用或者清洗多次之后，仍然可以保持催化活性，可以重复使用，有效降低工业化生产成本。由于几丁二糖脱乙酰酶来源于嗜热菌，酶自身可以耐受高温，且在高温下活性更高。但是现有的凝胶用于几丁二糖脱乙酰酶固定化时，往往不能耐受高温，只能在常温下作用效果才能比较长久。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于明胶水凝胶的几丁二糖脱乙酰酶固定化方法，制备的固定化几丁二糖脱乙酰酶能够在高温下使用，并且稳定性较好。

本发明的第一个目的是提供一种基于明胶水凝胶的几丁二糖脱乙酰酶固定化方法，包括如下步骤：

S1、向含有几丁二糖脱乙酰酶的酶液中，加入明胶，并加热使明胶溶解；

S2、加入京尼平，并按体积比1:0.8～1.2加入含有表面活性剂的氟化液，振荡混匀后冷却，并摇晃培养0.5～2天；

S3、按体积比，加入5～15％的1H,1H,2H,2H-全氟辛醇，并加入缓冲液，水油分层后取水相，静置后获得第一水凝胶；

S4、第一水凝胶经清洗后，加入缓冲液，并加入京尼平，摇晃培养1～5天，得到第二水凝胶，即为固定化几丁二糖脱乙酰酶。

进一步地，所述的明胶为A型明胶。

进一步地，所述的明胶的添加量为按质量体积比，加入5～15％明胶。

进一步地，所述的京尼平的浓度为40～60mg/mL，添加量为按体积比0.5～1.5％。

进一步地，所述的含有表面活性剂的氟化液中，表面活性剂的含量为0.05～1％。

进一步地，在S3步骤中，加入缓冲液后，静置4～10分钟水油分层。

进一步地，在S1步骤中，加热的温度为40～60℃。

进一步地，在S2步骤中，在0～4℃进行冷却。

本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的固定化几丁二糖脱乙酰酶。

本发明的第三个目的是提供所述的固定化几丁二糖脱乙酰酶在生产氨基葡萄糖中的应用。

本发明的有益效果是：