[发明专利]增强型MMLV逆转录酶突变体及其应用

说明书

本发明提供一种增强型MMLV逆转录酶突变体，在野生型在MMLV逆转录酶氨基酸序列（如SEQ ID No.1序列所示）进行16个氨基酸位点的突变，氨基酸突变位点如下：A70K；S142P；E201N；D206R；G248D；L300K；A307K；G331P；I434R；S453K；Y522G；E531G；E574G；E596G；E610G；E645G。本发明的MMLV增强型MMLV逆转录酶突变体具有更强的逆转录能力，可用于微量RNA的有效逆转录，可应用在单细胞转录组建库及微量RNA病毒检测等领域。

技术领域

本发明专利涉及增强型MMLV逆转录酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

在分子检测中经常遇到极低浓度的RNA样本，普通的逆转录酶对这种极低浓度的RNA无法进行有效逆转录，进而影响到了样本中RNA分子的检测，严重限制了微量RNA病毒检测、单细胞RNA分析等应用方面的技术开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强型MMLV逆转录酶突变体，对野生型MMLV逆转录酶氨基酸序列(SEQ ID No.1)的以下全部16个位点进行突变：A70K；S142P；E201N；D206R；G248D；L300K；A307K；G331P；I434R；S453K；Y522G；E531G；E574G；E596G；E610G；E645G。

本发明的另一目的是提供上述增强型MMLV逆转录酶突变体在进行逆转录反应中的应用。

本发明的增强型MMLV逆转录酶突变体具有更强的逆转录能力，可有效逆转录低至10pg Input Total RNA。本发明的增强型MMLV逆转录酶突变体用于微量RNA的有效逆转录，可应用在单细胞转录组建库及微量RNA病毒检测等领域。

附图说明

图1为阴性对照组扩增产物。

图2为10pg Input RNA使用MMLV逆转录酶突变体扩增产物。

图3为100pg Input RNA使用MMLV逆转录酶突变体扩增产物。

图4为10pg Input RNA使用MMLV逆转录酶野生型扩增产物。

图5为100pg Input RNA使用MMLV逆转录酶野生型扩增产物。

下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。

具体实施方式

实施例1

MMLV逆转录酶突变体，对野生型MMLV以下位点进行突变：A70K；S142P；E201N；D206R；G248D；L300K；A307K；G331P；I434R；S453K；Y522G；E531G；E574G；E596G；E610G；E645G。

参考Smart-seq2单细胞mRNA全长扩增方案，使用该突变的逆转录酶进行微量RNA的逆转录并使用Yeasen高保真酶SuperⅡ进行逆转录产物扩增，扩增产物使用HieffDNA Selection Beads进行纯化，纯化产物使用Agilent High SensitivityDNA Kit分析产物大小。实验操作在超净工作台内完成以避免污染。

表1：单细胞建库所用引物