[发明专利]一种基孔肯雅病毒E2蛋白兔单克隆抗体及其用途

说明书

本发明涉及生物医药技术领域。本发明提供了一株基孔肯雅病毒(CHIKV)E2蛋白兔单克隆抗体的氨基酸序列及其用途。本发明提供的一株CH IKV E2蛋白兔单克隆抗体的氨基酸序列包括抗体重链和轻链的氨基酸序列。用哺乳动物细胞表达的该抗体在体外可中和全球主要流行的CHIKV基因型对细胞的感染，在体内可保护I型干扰素受体基因敲除小鼠抵抗致死性CHIKV的感染。经过改造，如人源化改造或制备成单链抗体，有望用于重症CHIKV感染的治疗。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体地，本发明提供了一种CHIKV E2蛋白兔单克隆抗体的氨基酸序列及其在开发抗CHIKV感染治疗性抗体，包括人源化单抗和单链抗体中的应用。

背景技术

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是引起基孔肯雅热(Chikungunyafever)的病原体，其基因组是一种单股正链RNA，属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)成员。CHIKV是一类重要的虫媒病毒，伊蚊是其主要的传播媒介，人群普遍易感，除了引起发热和皮疹等症状以外，常可引起病程长达一年以上的慢性关节炎。近年来有报道CHIKV可引起更严重的疾病，包括脑炎和出血性疾病。目前CHIKV已传播至全球一百多个国家和地区，每年造成数百万人的感染，给人类生命健康带来巨大影响，是全球公共卫生的重大负担。针对CHIKV感染，目前无有效的治疗药物和商业化的疫苗。

CHIKV的基因组编码两个开放阅读框(ORF)。5’端的ORF编码非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)主要负责基因组RNA的复制；3’端的ORF编码结构蛋白(衣壳蛋白C、包膜蛋白E3、包膜蛋白E2、包膜蛋白E1)，负责病毒颗粒的形成。

结构蛋白的翻译产物为一个多聚蛋白前体，该多聚蛋白氨基端的衣壳蛋白通过自身的蛋白酶水解功能从多聚蛋白中释放出来，羧基端的多肽则在内质网内被宿主信号肽酶切割形成前体pE2蛋白、6K蛋白和E1蛋白，随后pE2由宿主细胞高尔基体中的弗林蛋白酶切割形成E3和E2蛋白。

衣壳蛋白包含两个结构域：N端的RNA结合域和C端的蛋白酶域。RNA结合域富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸，与带负电的基因组RNA相互作用。包膜蛋白E2是病毒的受体结合蛋白，主要负责CHIKV与细胞表面受体的结合。E2蛋白在结构上分为膜外区、茎区、跨膜区和膜内区4部分。CHIKV E2蛋白全长包括423个氨基酸残基(aa)，其中胞外区长约260aa，茎区约100aa，跨膜区约30aa，膜内区约33aa。膜外区在病毒吸附宿主细胞以及穿膜感染过程中起关键作用，含有中和抗体的表位；跨膜区进入脂质双分子层，膜内区在病毒在病毒颗粒内部，与核衣壳蛋白相互作用。E1蛋白属于第二类融合蛋白，主要负责膜融合。E1在结构上也分为膜外区、茎区、跨膜区和膜内区4部分。E2蛋白和E2蛋白形成异源二聚体，锚定于病毒颗粒的包膜表面。

CHIKV感染细胞起始于病毒与细胞表面受体的结合，CHIKV的E2蛋白与受体结合后，病毒颗粒通过受体介导的细胞内吞作用形成内体，进入细胞内，随着内体的成熟，内体的酸化引起CHIKV E1-E2异源二聚体构象发生变化，导致E1蛋白中的融合肽暴露并插入到内体膜中诱发病毒包膜与内体膜的融合；膜融合发生后，病毒核衣壳结构被释放到细胞质中，并短时间内迅速解体，释放出病毒基因组RNA，开始病毒基因的复制和蛋白的表达。

抗体治疗是用于治疗严重病毒感染的一种有效方法，在治疗埃博拉病毒、新型冠状病毒、呼吸道合胞病毒等病毒感染上显示了良好的效果。治疗性抗体成为治疗病毒感染的一类新的特效药物，研发抗病毒治疗性抗体是当前抗病毒药物研发领域的热点。虽然小鼠单克隆抗体技术非常成熟，但近年来兴起的兔单克隆抗体技术更具有抗体药物开发的优势。相比小鼠单克隆抗体，兔单克隆抗体具体如下特点：兔B细胞库容量大，抗体谱更广泛；具有高突变与基因转换二重抗体亲和力成熟机制，具有独特的互补决定区结构，因而与抗原的亲和力更高；在重链可变区有额外的二硫键，还有另一个连接可变区和恒定区的二硫键，因此其稳定性更高；兔单抗易于进行人源化改造。

发明内容