[发明专利]一种多重目标核酸的微滴式数字检测方法

权利要求书

1.一种多重目标核酸的微滴式数字检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)根据多重目标核酸制备环介导等温扩增反应所需的混合物；

其中所述混合物包括分别针对多重目标核酸设计的引物和探针组，所述引物和探针组中的每组包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP、环引物和蝎状引物探针；待检测的核酸；

(2)将步骤(1)获得的反应混合物作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成单分散的液滴；

(3)将步骤(2)所述的微流控芯片置于恒定温度下进行扩增反应；

(4)对步骤(3)所述反应后的微流控芯片中的液滴进行荧光信号检测及分析。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述蝎状引物探针的上游区域包含发夹结构，下游区域包含与环引物特异性互补的片段，所述互补的片段长度优选与环引物长度相同；并且，所述蝎状引物探针的5’端碱基上标记荧光基团，与其互补配对的对应碱基上标记淬灭基团。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述引物和探针组中的每组的蝎状引物探针所标记的荧光基团不同；

优选地，所述蝎状引物探针的径区包含7～8个碱基，环区包含7～8个碱基；

优选地，所述荧光基团选自FAM、TAMRA和/或Cy5，淬灭基团选自BHQ1和/或BHQ2。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述反应混合物还包含dNTP和聚合酶，优选为Bst 2.0 WarmStart^TM聚合酶；

当所述待检测的核酸包含RNA时，所述混合物还包含逆转录酶；优选为AMV逆转录酶；

优选地，所述反应混合物还包含荧光素钠、异硫氰酸荧光素或四乙基罗丹明中的一种或多种，更优选包含荧光素钠；

优选地，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄⁺、H⁺、Cl^-、SO₄^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂；

更优选地，所述反应混合物包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、X-100。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述分散相以微小体积单元的形式分散于连续相中；优选地，所述微小体积单元为10^-12～10^-15L；

优选地，所述油相为氟化油、矿物油、硅油和/或食用油中的一种或其混合；

优选地，所述油包含表面活性剂；

更优选地，所述油相为含Pico-Surf^TM1表面活性剂的氟化油；

优选地，所述微流控芯片为流动聚焦结构，包括：

油相入口，用于注入连续相；

水相入口，用于注入分散相；以及

出口，用于液滴收集。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述反应的温度为60-65℃，优选地为63-64℃。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述检测使用荧光显微镜进行。