[发明专利]一种肝细胞三维培养方法

说明书

本发明涉及一种肝细胞三维培养方法，它包括如下步骤：步骤一，将肝细胞放入含培养液的培养皿中，将培养皿放入37℃含体积含量为5％CO₂的培养箱中培养，当培养皿中的细胞密度达到80‑90％时进行传代，得到用于三维细胞培养的细胞悬浮液；步骤二，将步骤一中得到的细胞悬浮液和稀释水凝胶添加至孔板培养皿中进行混合，并调节细胞终浓度为1×10⁵/ml‑5×10⁵/ml，在室温下静置至凝固，得到细胞水凝胶混合物，其中稀释水凝胶中水凝胶与水凝胶稀释液按体积比为1:2‑1:4；步骤三，向步骤二中的孔板培养皿添加细胞培养液后，放置的培养箱中培养，每天半量更换细胞培养液，培养一段时间后得到三维细胞培养产物。通过实施本发明的方法能够得到一种用于药物筛选和毒物通路研究的模型。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是一种肝细胞三维培养方法。

背景技术

肝脏是人体重要的生命器官，体外构建人源肝细胞三维组织和器官芯片，不仅可以用于治疗肝坏死等肝脏疾病，也可以用于肝脏发育研究以及肝脏疾病治疗药物筛选的模型，还可以用于药物、重金属和有机污染物等毒物的肝脏代谢和肿瘤发生的毒性通路研究，有利于提出重要污染物的健康指导值，为食品相关政策提供技术支持。

三维细胞培养(three-dimensional cell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,细胞与周围微环境中的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、各种细胞因子、化学因子、物理机械力以及其它细胞发生交流与相互作用，并能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内细胞的生长、增殖、迁移、分化和凋亡的微环境，又易于形成具有合理形态和生理功能的组织器官，还能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势，所以三维细胞培养技术常被应用于药物载体、药物毒理、药物筛选、肿瘤治疗等方面的研究，但是，现有的培养方式针对不同应用需求通常需要进行针对的实验，这样会造成大量重复性劳动，降低研发效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公布了一种肝细胞三维培养方法，它包括如下步骤：

步骤一，细胞培养：将肝细胞放入含培养液的培养皿中，将培养皿放入37℃含体积含量为5％CO₂的培养箱中培养，当培养皿中的细胞密度达到80-90％时进行传代，得到用于三维细胞培养的细胞悬浮液；

步骤二，三维细胞培养准备：将步骤一中得到的细胞悬浮液和稀释水凝胶添加至孔板培养皿中进行混合，并调节细胞终浓度为1×10⁵/ml-5×10⁵/ml，在室温下静置至凝固，得到细胞水凝胶混合物，其中稀释水凝胶中水凝胶与水凝胶稀释液按体积比为1:2-1:4；

步骤三，三维细胞培养，向步骤二中的孔板培养皿添加细胞培养液后，放置的培养箱中培养，每天半量更换细胞培养液，培养一段时间后得到三维细胞培养产物。

进一步的，所述步骤一中培养液为体积百分含量10％胎牛血清的1640培养液。

进一步的，所述步骤二中最优细胞浓度为1.1×10⁵。

进一步的，所述步骤二中最优水凝胶与水凝胶稀释液体积比为1：3.7。

进一步的，所述步骤三中最优培养时间为9.5天。

进一步的，还包括步骤二(1)预测步骤，所述步骤二(1)设置在步骤二与步骤三之间，其包括：根据如下预测模型以需要的细胞活性OD值确定细胞浓度、培养时间和水凝胶与水凝胶稀释液体积比：

Y＝2.11-3.625×