[发明专利]一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法

说明书

本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法。适配体序列如SEQ.NO.1‑5所示，本发明以变形假单胞菌为研究对象，采用反筛等SELEX技术，筛选能特异性识别变形假单胞菌温度敏感位点的核酸适配体，通过测定亲和力的变化来表征核酸适配体对温度敏感位点进行识别。本发明可对高频序列进行客观有效的分类，为后续核酸适配体的精准选择和验证提供了一种客观有效的依据，该方法简单，操作方便，大大减少了验证的盲目性，提高了筛选效率。从筛选结果中挑选相对重要指数最高的五个适配体M19、M56、M17、M48、M81，这些适配体对18℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对18℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性。

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法。

背景技术

核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(SystematicEvolutionofligandsbyExponentialEnrichment，SELEX)筛选出的对靶目标具有较高亲和特异性的寡核苷酸分子。Ellington等人于1990年首次报道，利用体外筛选技术从随机文库中分离出罕见的RNA分子，这些RNA分子可以任意地与所选的靶分子结合，Ellington将这些产生得到的基序命名为“适配体(aptamer)”。由于核酸适配体具有多项优势：(1)核酸适配体的体积小，质量在6-30KDa之间，大小约为5nm；(2)核酸适配体结构简单，易化学修饰；(3)核酸适配体化学稳定性高；(4)核酸适配体免疫原性低；(5)核酸适配体组织渗透率高；(6)核酸适配体的靶目标范围广：可为离子、小分子、多肽、蛋白质、病毒、细菌、寄生虫和整个活细胞等；(7)核酸适配体可识别细胞表面功能分子：需借助配体或翻译后修饰；被广泛应用于生物医学、蛋白质科学、纳米材料及疾病诊断等各研究领域。核酸适配体在水产病害方面也有应用，目前已成功筛选到特异性核酸适配体的水产病原有病毒性出血性败血症病毒(Viralhemorrhagicsepticemiavirus，VHSV)，新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)，赤点石斑鱼神经坏死症病毒(RedspottedgroupernervOusnecrosisvirus，RGNNV)，牙鲆弹状病毒(Hiramerhabdovirusvirus，HIRRV)，鲤春病毒血症病毒(Springviremiaofcarpvirus，SVCV)，中华鳖虹彩病毒(Soft-shelledturtleiridovirus，STIV)，副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)，溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等。

变形假单胞菌隶属于假单胞菌科，假单胞菌属，恶臭假单胞菌组，杀香鱼假单胞菌种，是一种直或微弯、不呈螺旋状的革兰氏阴性杆菌，以单极毛或数根极毛运动，需氧，不生芽孢，感染的鱼类品种主要集中在香鱼、石斑鱼和大黄鱼，被感染的大黄鱼主要表现为部分病鱼有腹水，肝、脾、肾等内脏组织与器官都表现出不同程度的充血、出血、坏死，其中肝脏严重充血，脾脏和肾脏布满白色小结节。根据病鱼脾、肝脏、肾等内脏长满白色结节而命名该病为大黄鱼内脏白点病，发病温度在特定温度15℃到20℃之间，是近年来在大黄鱼养殖中暴发流行的一种细菌性疾病，给养殖产业造成了重大的经济损失。目前，尽管大黄鱼内脏白点病的研究报道已有多篇，但是主要集中在病理形态学分析等，其致病机制虽然与胞外产物有一定相关性，但是还不能完全解释其致病性，因此迫切需要对变形假单胞菌的致病机理的研究思路和研究方法，识别变形假单胞菌对温度敏感的位点，揭示变形假单胞菌的温度敏感机制。

一般的核酸适配体对温度具有弱敏感性，而变形假单胞菌发病温度在15℃到20℃之间，因此筛选温度敏感位点适配体，并利用这些核酸适配体来识别相应的温度敏感位点，对研究变形假单胞菌的温度敏感机制，从而为变形假单胞菌的病害防治提供参考具有重大意义。

发明内容