[发明专利]一种基于2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种基于2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的制备

用三聚氰胺和2,4,6-三氨基嘧啶共聚制备了2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，将1 g 三聚氰胺和10 ~ 50 mg的2,4,6-三氨基嘧啶充分均匀地混合在玛瑙研钵中进行研磨，然后将混合物置于带盖的坩埚中，在马弗炉中以5 ℃ min^-1升温速率升至550 ℃保持加热4 h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，不添加2,4,6-三氨基嘧啶时，其他条件都相同，制备了原始的类石墨相氮化碳；

（2）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备

将5 ~ 20 µg mL^-1的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）进行活化，然后与2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；

（3）Fe-ZIF的制备

先将1 ~ 3 g的2-甲基咪唑溶于30 mL无水甲醇中，记为溶液A；此外将0.1 ~ 0.5 g七水合硫酸亚铁和0.6 ~ 1 g六水合硝酸锌混合溶于30 mL无水甲醇，记为溶液B；将两种溶液混合搅拌均匀，并在35 ℃下不断搅拌反应4 h，将反应完成的混合溶液离心，收集所得产物，并用无水甲醇洗涤离心3次，将洗涤后的产物于60 ℃真空干燥箱中烘干过夜，得到Fe-ZIF粉末；

（4）硫化铜量子点的制备

将20 ~ 50 mg九水合硫酸钠溶于3 mL去离子水中得到硫化钠溶液备用，将50 ~ 100mg氯化铜与80 ~ 100 mg柠檬酸三钠溶于300 mL超纯水中，磁搅拌得到浅蓝色透明溶液，将充分溶解的溶液进行加热，于90 ℃下反应30 min，在加热过程中缓慢滴加上述硫化钠溶液，在这过程中可以观察到溶液逐渐变为墨绿色，且有沉淀生成，将反应完成后的悬浮液离心，收集所得产物，并用超纯水洗涤离心3次，将洗涤过后的硫化铜量子点悬浮液溶于5 mL去离子水中在4 ℃下保存备用；

（5）Fe-ZIF负载硫化铜量子点复合材料的制备

将制得的50 ~ 100 mg的 Fe-ZIF粉末溶于300 mL去离子水中，磁搅拌使其充分分散，然后缓慢滴加上述硫化铜量子点悬浮液，使Fe-ZIF对硫化铜量子点进行充分负载，搅拌8 h后将混合溶液进行离心，收集所得产物，并用去离子水洗涤离心3次，将洗涤过后的产物于60 ℃真空干燥箱中烘干过夜，即得到Fe-ZIF负载硫化铜量子点复合材料；

（6）PBS缓冲溶液的配置

取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol L^-1的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15mol L^-1的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；

（7）Fe-ZIF负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备

将20 ~ 100 μL 神经元特异性烯醇化酶二抗（10 μg mL^-1）加入到1 mL 1 ~ 3 mg mL^-1Fe-ZIF负载硫化铜量子点复合材料水溶液中，并在4 ℃下震荡孵化12 h，离心后将得到的产物分散在1 mL PBS中，即得Fe-ZIF负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；

（8）电化学免疫传感器的制备

1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、0.5 ~2.5 mg mL^-1的2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；

2）继续滴加3 µL、质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；

3）继续滴加6 µL、0.00005 ~ 100 ng mL^-1的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

4）最后滴加6 µL的Fe-ZIF负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。