[发明专利]含有靶蛋白的外来体

说明书

本发明涉及一种含有靶蛋白的外来体。本发明的外来体包含外来体特异性标记物和靶蛋白的融合蛋白。利用本发明提供的制备含有靶蛋白的外来体的方法，能够以高收率制备含有靶蛋白的外来体，从而能够在利用外来体来治疗疾病方面广泛地使用。

技术领域

本发明涉及涉及一种含有靶蛋白的外来体。具体地，利用光特异性结合蛋白来制备含有靶蛋白的外来体的方法、由此方法制备的外来体，以及利用由所述制备方法制备的外来体将靶蛋白传递至细胞质的方法。

背景技术

人体大致由200多种的100万亿个细胞组成，生理活性通过细胞内的各种蛋白质的作用来调节，以维持生命。

细胞被由磷脂组成的双层膜结构的细胞膜所包围，细胞膜阻止异物进入细胞。迄今为止开发的蛋白质治疗剂仍不能透过细胞膜进入细胞质内，而是作用于细胞外部，或者作用于细胞膜上的受体(receptor)以将信号传递至细胞内，从而显示出生理效果。

细胞质中存在大量的蛋白质，它们通过相互作用来调节生理活性，如果能够将蛋白质治疗剂直接放入细胞内，即放入细胞质内，则细胞活性将能够得到更有效的控制。

最近，正在积极展开对于使靶蛋白通过细胞膜而直接流入细胞内的方法的研究。当制备通过细胞膜的作为肽的细胞膜通过区域(蛋白转导离子区域(Protein Transduction Domains，PTDs))和靶蛋白的重组蛋白(recombinant protein)而进行施用时，则可以通过细胞膜进入到细胞质内(图1)。作为细胞膜通过蛋白转导域(PTD)，例如有HIV-1TAT、HSV VP22、Antp、dfTAT、Hph-1等，将其与靶蛋白结合的融合蛋白以重组蛋白形态进行生产后，需要进行分离的过程，但在该过程中，存在不能正常进行蛋白质重折叠(refolding)的问题，从而会导致活性降低，蛋白质被非特异性传递，在活体内引起免疫反应的风险大，而且费用昂贵，还存在收率低的问题。

与各种纳米颗粒(nanoparticle)结合的靶蛋白可以通过内吞作用(Endocytosis)通过细胞膜而进入到细胞质内(图2)。纳米颗粒的例子有，金NP(Gold NP)、脂质体NP(Liposome NP)、磁性icNP(Magnet icNP)、聚合物NP(Polymeric NP)等，它们与靶蛋白的结合体的分离大部分发生在细胞内的溶酶体(lysosome)中，因此靶蛋白在溶酶体内部进行分解而失去活性，或者因靶蛋白与纳米颗粒在细胞质中难以进行分离，从而使纳米颗粒具有毒性，这会成为问题。

外来体(Exosome)为具有50～200nm大小的膜结构的小囊泡，其含有蛋白质、DNA和RNA等，向细胞外分泌，用于细胞间的信号传递。

外来体是在以下过程中被发现的。即在红细胞成熟的最后阶段，通过排出并去除细胞内的蛋白质，从而使得红细胞内仅存留血红蛋白的过程中发现的。在通过电子显微镜来研究这种外来体时发现，该外来体不直接从细胞质膜(plasma membrane)分离，而是从被称为多泡体(Mult ivesicular bodies，MVBs)的细胞内特异性分离区排出并分泌到细胞外的。即，多泡体和细胞质膜进行融合时，这样的小囊泡就会被释放到细胞外的环境中，将其称为外来体(图3)。

虽然还不能明确地确定这种外来体是基于什么样的分子机制而产生的，但是已知包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突细胞、巨核细胞(megakaryocyte)和巨噬细胞等在内的多种免疫细胞与干细胞及肿瘤细胞等在存活的状态下，会生产并分泌外来体。

外来体包含细胞内的各种蛋白质、DNA、RNA等。被包含在这样的外来体中而向细胞外分泌的物质通过与细胞膜之间的融合(fusion)或内吞作用(endocytosis)而会再次流进其它的细胞内，从而起到细胞间信使的作用。此外，通过对包含在这种外来体中而向细胞外分泌的物质进行分析，可以用于诊断特异性疾病。