[发明专利]一种基于免疫荧光增强的外泌体定量检测方法

说明书

本发明公开一种基于免疫荧光增强的外泌体定量检测方法。方法包括步骤：采用离心法提取外泌体或将待测体液如血液稀释；将金属纳米粒子荧光探针与外泌体或稀释后的待测体液结合，然后置于金属纳米膜上进行荧光成像，实现外泌体或待测体液中外泌体定量检测。本发明建立基于免疫增强的荧光检测方法，获得外泌体或特异性来源外泌体的增强荧光信号，建立标准曲线，获得待检测外泌体的浓度，能够满足外泌体及不同外泌体亚群的实验室及临床定量检测需求。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种基于免疫荧光增强的外泌体定量检测方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中直径为30-100nm膜性小囊泡，内容物丰富，携带有蛋白、脂质和miRNA等。外泌体可由机体多种类型细胞释放，广泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁、组织液等体液中。作为一种分子媒介，外泌体可以促进细胞间或器官间的信息交流，参与多种生理病理过程，与疾病的发生、发展和进程密切相关。外泌体能反映来源细胞的功能，病理条件下，其内容物组分较健康状态有所不同。外泌体及不同来源的外泌体具有不同的特异性表面标志蛋白，如ALIX,Annexin,ANXA5,CD171,CD31,CD44,CD63,CD81,CD9,Claudins,EpCAM,FLOT1,GM130，HLA-G，HSP5，HSP70，HSP90，ICAM-1，Integrins，RAB5,SNAP,TIM,TSG101等。根据表面标志蛋白的不同，可以将外泌体分为不同亚群，或称为不同来源外泌体(如肿瘤来源、神经来源、胎盘来源等)。识别和定量外泌体及不同外泌体亚群，能够为疾病的预测、诊断，疗效评估及预后提供信息。而在评价外泌体(总外泌体、不同亚群外泌体)分离纯化方法和分离效果时，亦需对分离到的外泌体进行定量。

用于外泌体定量检测的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹(Western blot)、微流控、质谱等。外泌体尤其是不同亚群的外泌体，在体液中的含量低，目前尚缺乏快速、简便、灵敏度高、经济适用的检测方法。免疫荧光是生物医学检测中一种重要的方法，但现有方法存在荧光亮度不高，易于淬灭等缺点。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于免疫荧光增强的外泌体定量检测方法，旨在解决现有免疫荧光方法存在荧光亮度不高的问题。

本发明的技术方案如下：

一种基于免疫荧光增强的外泌体定量检测方法，其中，包括步骤：

采用离心法提取外泌体或将待测体液如血液稀释；

将金属纳米粒子荧光探针与外泌体或稀释后的待测体液结合，然后置于金属纳米膜上进行荧光成像，实现外泌体或待测体液中外泌体定量检测。

可选地，所述金属纳米粒子荧光探针由金属纳米棒(gold nanorods,GNRs)、外泌体表面标志蛋白抗体和荧光剂结合而成。

可选地，所述金属纳米棒为金纳米棒。

可选地，所述外泌体表面标志蛋白抗体选自抗ALIX抗体、抗Annexin抗体、抗ANXA5抗体、抗CD171抗体、抗CD31抗体、抗CD44抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗CD9抗体、抗Claudins抗体、抗EpCAM抗体、抗FLOT1抗体、抗GM130抗体、抗HLA-G抗体、抗HSP5抗体、抗HSP70抗体、抗HSP90抗体、抗ICAM-1抗体、抗Integrins抗体、抗RAB5抗体、抗SNAP抗体、抗TIM抗体和抗TSG101抗体等抗体中的一种，包括单克隆或多克隆抗体。

可选地，所述荧光剂为AF647染料。

可选地，所述金属纳米膜为纳米银膜；

或者，所述金属纳米膜为纳米银膜和形成于所述纳米银膜上的PC668光子晶体膜构成的复合膜；

或者，所述金属纳米膜为纳米金膜。