[发明专利]一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸检测方法

说明书

本发明公开了一种牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的可视化快速核酸检测方法，该方法针对牛结节性皮肤病病毒的orf068基因设计RPA引物并进行扩增，然后向扩增产物中加入Cas12a蛋白并进行酶切反应，反应体系包括Cas12a蛋白、sgRNA和核酸探针，即可对核酸探针发出的信号进行检测。本发明检测orf068质粒的灵敏度是5copies/μL,检测LSDV和山羊痘病毒(GTPV)的灵敏度均为0.1TCID₅₀/μL，检测临床样本的诊断敏感性为96.3％(95％CI：81.0％，99.9％)，且特异性高，眼观颜色变化判断结果，具有简便、快速和适合现场检测等优点。

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统介导的核酸可视化检测技术，用于快速检测牛结节皮肤病(LSD)的方法及试剂盒。

背景技术

牛结节皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skindisease virus，LSDV)引起的一种皮肤病，以发热、皮肤水肿及局部坚硬的结节为主要特征，会严重妨碍养牛业的发展。LSD可以导致巨大的经济损失。如乳牛产奶量减少、肉牛生长性能下降、公牛暂时或永久不育、破坏皮张利用价值等。该病发病率在2％～45％之间，致死率高达20％，奶牛更为易感，已被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的疫病之一。

2019年8月，在中国新疆发现了第一起牛结节性皮肤病疫情，之后哈兽研首次分离病毒，命名为：LSDV/China/Xinjiang/2019(Xinjiang/2019)。测序全基因组分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017(Genbank：MH646674.1)同源性最高(99.42％)。2020年在全国多个省份流行，且有全国蔓延趋势。我国相继定为外来动物疫病和二类动物疫病。我国之前没有LSDV病的流行，缺乏有效的疫苗。绵羊痘病毒、山羊痘病毒和牛结节皮肤病病毒均属于羊痘病毒属，基因组相似度达到96％以上，我国使用山羊痘病毒弱毒疫苗对牛进行免疫，对LSDV起到了很好的预防效果。

由于此前中国没有牛结节皮肤病，因此大多数的检测方法都是国外创建的。常规核酸检测方法主要是有PCR，qPCR，但是都存在需要昂贵的设备、专业的操作人员、反应时间长等缺点，很难做到在农场中普及使用。近年来，等温扩增技术如环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)等因其不需要昂贵的设备、反应快速，灵敏度高等优点发展迅速，逐渐在临床上应用起来。LAMP方法扩增能力强，但是不能对结果进行定量判定，只能简单的进行有无判定，并且容易在实验室形成气溶胶，造成假阳性。而RPA技术在扩增过程中容易引起非特异性扩增，结果检测需要凝胶电泳或者对产物进行纯化，很不方便。为防止LSD的传播，因此建立快速、灵敏、特异的检测方法对于病毒的防控至关重要。快速检测要求检测过程能在样品采集地完成(point-of-care testing,POCT)，而不依赖于实验室大型仪器设备。这是检测方法学发展的必然。

CRISPR-Cas是一种存在于细菌和古生菌的防御及适应性免疫系统，其能够切割和消除病毒入侵和其他外源核酸的威胁。CRISPR-Cas系统利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。Cas12a便是其中一类，它不仅特异性的精准切割和其crRNA匹配的并含有PAM(TTTN)序列的双链DNA。它在特异性切割目标双链DNA之后，附带效应被激活，将非特异性无差别切割它附近的任何单链DNA。它对单链DNA切割速度极快，达到大于1000个分子每秒。利用此特性，可将荧光基团通过单链DNA与一种淬灭剂连接在一起(简称为报告序列)。当Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，它会切割报告序列，让荧光基团摆脱淬灭剂的限制而发光，从而检测到光信号，进而判断是否存在靶基因。该方法结合LAMP和RPA技术已经成功应用到了非洲猪瘟、新冠肺炎病毒、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、人乳头瘤病毒、寨卡和登革热病毒和支原体的检测上。