[发明专利]利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法

权利要求书

1.一种利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一 Lipase-tat融合基因的设计及获得

登录GeneBank得到海洋微生物低温脂肪酶基因序列，根据文献查阅得到PTD-Tat基因片段序列，通过人工合成的方法将PTD-Tat基因片段与海洋微生物低温脂肪酶基因连接，并添加酶切位点Nco I和Xho I，得到融合基因Lipase-tat，并对所述融合基因Lipase-tat进行优化；

优化后的、未添加酶切位点Nco I和Xho I的Lipase-tat融合基因序列如下：CTGCCATCTGGTTCTGATCCGGCATTTAGTCAGCCAAAAAGCGTGCTGGACGCAGGTCTGACCTGTCAAGGCGCAAGTCCAAGTAGCGTCTCTAAACCGATTCTGCTGGTTCCAGGTACGGGTACCACCGGTCCACAAAGTTTTGATAGCAACTGGATTCCGCTGAGTACCCAACTGGGTTATACCCCGTGTTGGATTAGTCCACCGCCATTCATGCTGAACGATACCCAGGTCAACACCGAATACATGGTCAACGCGATTACCGCACTGTATGCAGGTAGCGGCAATAACAAACTGCCGGTTCTGACCTGGAGTCAAGGCGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTTTTCCCGAGTATTCGCAGCAAAGTCGATCGTCTGATGGCATTTGCGCCGGATTACAAAGGTACCGTTCTGGCAGGTCCACTGGACGCACTGGCAGTTTCTGCACCGAGCGTGTGGCAACAAACCACCGGTTCTGCACTGACCACCGCACTGCGTAACGCAGGCGGTCTGACCCAAATTGTTCCAACCACCAACCTGTATAGCGCGACCGACGAAATTGTCCAACCGCAAGTTAGCAATAGTCCGCTGGATTCCAGCTACCTGTTCAACGGCAAAAACGTCCAGGCACAAGCTGTTTGCGGTCCGCTGTTTGTTATTGATCACGCAGGTTCTCTGACCAGCCAGTTTAGCTACGTTGTTGGTCGTAGCGCACTGCGTAGTACCACCGGTCAAGCACGTTCTGCAGATTACGGCATTACCGATTGCAACCCACTGCCAGCAAACGATCTGACCCCAGAACAGAAAGTTGCAGCAGCAGCACTGCTGGCACCAGCAGCAGCAGCAATTGTAGCAGGTCCAAAACAGAACTGCGAACCGGATCTGATGCCATACGCACGTCCATTTGCAGTTGGTAAACGCACCTGTTCTGGTATTGTTACCCCATACGGTCGCAAAAAACGTCGTCAACGTCGTCGT

步骤二 pET28a-Lipase-tat载体的构建

A1 应用Nco I和Xho I酶切Lipase-tat，胶回收酶切片段；

A2应用Nco I和Xho I酶切pET28a载体，胶回收获得线性化的pET28a载体片段；

A3连接所述酶切片段和pET28a载体片段，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，菌落PCR检测；将PCR检测获得的阳性菌落扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒；

步骤三 Lipase-tat蛋白原核表达与纯化提取

B1蛋白原核表达：用所述pET28a-Lipase-tat重组表达载体质粒转化表达菌株感受态细胞Rosseta DE3，得到诱导表达后的菌液；

B2分离纯化：将诱导表达后的菌液进行分离纯化，得到纯化重组蛋白；

B3活力检测：检测所述纯化重组蛋白的活力。

2.根据权利要求1所述的利用PTD-Tat实现海洋微生物低温脂肪酶基因的跨膜转导方法，其特征在于，所述步骤二中的A1步骤中，酶切Lipase-tat过程中的酶切体系为：Lipase-tat基因，10×FastDigest Buffer，NcoI ，XhoI，去离子水，33-40℃孵育8-15min，然后60-70℃孵育10-20min；将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，备用。