[发明专利]一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法

说明书

本发明公开了一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法，该草地贪夜蛾种特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明基于线粒体DNA COⅠ基因开发的草地贪夜蛾的种特异性引物，利用草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫和玉米螟5种鳞翅目昆虫对草地贪夜蛾的种特异性引物对进行种特异性检验，进一步建立种特异性引物与线粒体COⅠ基因通用引物的多重PCR反应体系，以COⅠ通用引物的扩增产物作为PCR反应的内对照，用于检测所检测材料中是否存在可供检测的DNA，为草地贪夜蛾的快速识别与疫情监控提供技术手段。

技术领域

本发明涉及一种昆虫鉴别方法，具体涉及一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法。

背景技术

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种世界性的重大农业害虫，作为入侵种对我国的粮食安全和生态安全构成严重威胁，因此对草地贪夜蛾进行快速准确的识别鉴定是草地贪夜蛾综合防控、保障农林业安全和生态环境安全的必要前提。

国内田间调查发现草地贪夜蛾常与斜纹夜蛾Spodoptera litura、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、粘虫Mythimna separata等鳞翅目昆虫混合发生，形态特征和为害特点均较为相似，经验缺乏者仅从形态上难以进行区分，同时传统的形态学鉴定方法易被虫态(如卵、幼虫、蛹)、残体、亚群、性别等影响，加大草地贪夜蛾快速准确鉴定的难度。基于目前存在的问题，亟待开发特定的分子鉴定技术，补偿传统形态学鉴定的局限，提高物种鉴定的准确性和时效性。

2003年，Hebert等提出基于线粒体DNA CO Ⅰ基因的DNA条形码(DNA barcoding)对生物进行物种鉴定，该技术不受虫态、虫体完整性、性别等局限，且易操作实施、重复性好，已在昆虫纲的种类鉴定中得到广泛应用，包括鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等31个目。2019年，张磊等利用线粒体DNA CO Ⅰ基因对入侵云南的草地贪夜蛾进行分子鉴定，然而该方法需要进行大量的测序、序列比对及构建系统进化树等，步骤繁琐、耗时长。

发明内容

本发明的目的是提供一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法，建立种特异性引物与线粒体CO Ⅰ基因通用引物的多重PCR反应体系，以CO Ⅰ通用引物的扩增产物作为PCR反应的内对照，用于检测所检测材料中是否存在可供检测的DNA，为草地贪夜蛾的快速识别与疫情监控提供技术手段。

为了达到上述目的，本发明提供了一种草地贪夜蛾种特异性引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一目的是提供一种用于鉴别草地贪夜蛾的种特异序列，该种特异序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的另一目的是提供一种采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的种特异性引物对检测草地贪夜蛾的试剂盒。

优选地，该试剂盒中还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的线粒体DNA CO Ⅰ通用引物对。

本发明的另一目的是提供一种基于多重PCR鉴别草地贪夜蛾的方法，该方法采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的种特异性引物对及核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的线粒体DNA CO Ⅰ通用引物对进行多重PCR反应，若扩增得到349bp和750bp的扩增产物，则待测昆虫为草地贪夜蛾。

优选地，该方法的多重PCR反应体系的成分包含：Taq DNA Polymerase、10×TaqBuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的种特异性引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的线粒体DNA CO Ⅰ通用引物对、待测昆虫的DNA基因组、ddH₂O。