[发明专利]一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用

说明书

本发明公开了一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用，其中，所述成纤维细胞的保藏号为CCTCC No：C2019202。本发明在羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS的分离过程中分别采用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液以及Ⅳ型胶原酶处理羊胎儿皮肤组织，然后用含0.01‑0.05%胰蛋白酶‑EDTA消化液处理细胞；并采用3%胎牛血清+10‑40ng/ml的h‑EGF替代10%的胎牛血清培养羊胎儿皮肤成纤维细胞，使胎牛血清使用量大大减少，降低了SFSFS培养成本和羊口疮病毒生产成本，节约了资源。本发明的细胞株能够明显提高羊口疮病毒的分离率、缩短分离时间，且分离的羊口疮病毒毒价和病毒拷贝数也更高，可以为羊口疮病毒的规模化繁殖及病毒感染致病机制研究提供工具。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种羊胎儿皮肤成纤维细胞，本发明同时还涉及该细胞的分离方法及应用。

背景技术

羊传染性脓包皮炎（Contagious Ecthyma，CE）俗称羊口疮，是由羊口疮病毒（ORFvirus，ORFV）引起的山羊、绵羊、主要羔山羊易感的一种急性、接触性传染病，也是一种人和其他动物均可感染的人畜共患传染病。ORFV主要在内蒙、西藏、新疆、云南、甘肃、四川、宁夏等养羊业密集地区流行，近年来频繁发生于宁夏、内蒙古、新疆、西藏、山东、湖北、云南、陕西和黑龙江、青海等地区。发病羊的嘴唇、口腔黏膜、舌头和鼻孔等部位会出现菜花状增生的典型症状，严重影响其采食和生产，且羊的死亡率也逐年攀升，对养羊业造成重创，而目前控制羊口疮最有效的方法是接种疫苗，因此，从发病羊群中分离鉴定羊口疮病毒，并利用该病毒分离毒株、研制出针对地方性ORFV的有效疫苗，对于羊口疮的预防及治疗具有重要的意义。

对于预防羊口疮疫苗的制备，主要包括以下方面：第一，通过不断分离、培养牛或羊原代细胞，从中分离出羊口疮病毒，然后连续传代进行弱化，进而制备弱毒疫苗；第二、目前也有灭活疫苗研发趋势；第三，由于羊口疮病毒表面覆盖着一个形如小管、纵横交错排列的囊膜覆盖了其抗原表位，导致羊体内产生的中和抗体少，对羊的保护率也较低，鉴于这种免疫学上的特殊性，有研究者用超声波等手段将ORFV的囊膜破坏再制备羊口疮疫苗，但上述几种情况都仅限于实验室研究，并没有在生产上大规模使用。主要原因在于：分离原代细胞费时、费力，费用昂贵，原代细胞传代次数少，培养的羊口疮病毒毒价低，批内生产量小、批间重复性因原代细胞的不同也难以一致。故急需开发传代次数多，培养费用低廉，繁殖病毒滴度较高的细胞，从而为羊口疮病毒的分离、规模化繁殖、工业化生产以及病毒感染致病机制的研究提供工具。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种传代次数多、培养成本低廉、培养病毒毒价高的羊胎儿皮肤成纤维细胞。

本发明的的另一目的是提供上述羊胎儿皮肤成纤维细胞的分离方法。

本发明的再一目的是提供上述羊胎儿皮肤成纤维细胞在羊口疮病毒的规模化繁殖及病毒感染致病机制研究中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2019年9月22日，保藏编号为CCTCCNo.C2019202。

上述羊胎儿皮肤成纤维细胞的分离方法如下：

步骤1、羊胎儿皮肤成纤维原代细胞的分离

无菌取出羊胎儿，剪一小块皮肤组织，用pH7.0、浓度为0.05mol/L的PBS冲洗数次后，无菌剪碎，然后先用Ⅳ型胶原酶消化0.5-1h，加入1%胎牛血清终止消化，离心，沉淀用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液37℃保温消化10-30min后加入5%胎牛血清，过滤，滤液离心，弃上清，沉淀即为羊胎儿皮肤成纤维原代细胞，用含10%胎牛血清的基础培养基重悬铺板或冻存；

步骤2、羊胎儿皮肤成纤维细胞的优选