[发明专利]一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种生物合成2‑苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用，构建方法包括，敲除所述受体菌的cg0641基因或抑制所述cg0641基因的表达或抑制所述cg0641基因编码的蛋白质的活性，获得突变株PE1；增加所述突变株PE1中酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强所述酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE2；增加所述突变株PE2中酪氨酸转氨酶编码基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强转氨酶基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE3。本发明所构建的高产2‑苯乙醇的谷氨酸棒杆菌安全，且克服了现有的菌株生产效率低、耐受性缺陷等缺点，该菌株可以利用葡萄糖和秸秆水解液好氧发酵生产2‑苯乙醇，发酵产量达到5.3g/L。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用。

背景技术

2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香味的芳香醇,在化妆品、食品和医药等领域有着广泛的应用。目前，生产2-苯乙醇的方法有化学合成法、植物提取法和生物合成法。化学合成法以石油基苯或苯乙烯为原料，不但原料具有致癌风险，而且产物中常含有一些难以去除的副产物，严重影响产品质量，从而限制其使用范围；植物提取法和生物合成法生产的2-苯乙醇具有很好的生物安全性，且被认定为“天然”级，因此市场需求量日益增加。然而，从植物中提取2-苯乙醇生产周期长、成本高，无法进行大规模生产，生物合成法作为一种原料可再生和环境友好型的制造方式能从根本上解决化学合成和提取方法的弊端。

目前，能合成2-苯乙醇的微生物细胞工厂主要有两类：第一类是酿酒酵母，另外一类是通过代谢工程改造的大肠杆菌。酿酒酵母生物合成2-苯乙醇主要通过2种途径：艾氏途径和莽草酸途径，艾氏途径合成2-苯乙醇仅需要3步反应，代谢途径短，是提高2-苯乙醇产量的关键途径。然而，酿酒酵母合成2-苯乙醇周期较长，其生产率相对较低，因此，有研究者对生长速度较快、遗传背景清晰的大肠杆菌进行改造用于2-苯乙醇的合成。以E.coliMG1655为出发菌株，共表达芳香族氨基酸转氨酶基因aro8、2-酮酸脱羧酶编码基因kdc和醇脱氢酶编码基因yigB，2-苯乙醇发酵产量提高到0.28g/L。在大肠杆菌中利用谷氨酸脱氢酶设计一个“桥梁”构建辅因子自平衡的细胞工厂，无需外源添加任何辅因子，细胞催化效率提高近4倍，实现了苯丙氨酸高效转化为2-苯乙醇。尽管多种代谢工程改造策略的应用，2-苯乙醇发酵产量还处于较低水平，这是由于高浓度的2-苯乙醇会抑制菌株的生长。2g/L的2-苯乙醇可以完全抑制大肠杆菌的生长，4g/L的2-苯乙醇几乎完全抑制酿酒酵母的生长。选育或者改造获得耐受性优异的高产细胞工厂是降低生产成本、提高产量的有效途径。

谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物菌种，具有耐受高强度发酵的鲁棒性、环境适应性强等特点，已被广泛用于氨基酸的工业发酵，以及有机酸、核苷酸和醇类等生物基化学品的制造。此外，其对木质纤维素糖化液中芳香族化合物的降解及耐受能力与一般的工业微生物菌种相比有着明显的优势，因此能较好地利用木质纤维素类等可再生原料。目前，利用谷氨酸棒杆菌作为宿主构建细胞工厂生物合成2-苯乙醇还未见报道。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括，

敲除所述受体菌的短链脱氢酶编码基因或抑制所述短链脱氢酶编码基因的表达或抑制所述短链脱氢酶编码基因编码的蛋白质的活性，获得突变株PE1；

增加所述突变株PE1中酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强所述酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE2；