[发明专利]一种纳豆芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及遗传转化方法

说明书

一种纳豆芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及遗传转化方法，包括将冷冻保藏的纳豆芽孢杆菌在LB固体培养基上划线，37℃条件下培养16‑20h，在划线平板上挑一个单菌落，接种于盛有LB液体培养基的三角瓶中，37℃条件下以180‑250rpm摇床培养12‑16h；取培养液，接种于BN‑Ⅰ培养基中，37℃条件下以180‑250rpm摇床培养12‑16h；取菌液接种于BN‑Ⅰ培养基中，37℃条件下以180‑250rpm摇床培养4‑5h；取菌液接种于BN‑II培养基中，37℃条件下以180‑250rpm摇床培养1‑2h；向菌液中加入促转化液，37℃条件下以80‑120rpm摇床培养10‑30min；培养结束后得到含有感受态细胞的菌液。本发明制备的纳豆芽孢杆菌感受态细胞，其转化率得到大幅提升，后续将为该菌的基因表达、沉默、敲除及功能研究提供基础。

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种纳豆芽孢杆菌感受态细胞的制备及遗传转化方法。

背景技术

随着生物信息学及分子遗传学技术的快速发展，通过基因工程技术对具有潜在应用价值的优良菌种进行遗传改良备受青睐。细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。感受态细胞就是通过处理使细胞的通透性变大，使外源基因或载体进入感受态细胞，由于细胞膜的流动性，孔洞会被细胞自身修复。基因工程改造的关键技术瓶颈之一就是遗传转化技术，只有将需要改造的目的基因导入到目标菌株之后才能对目标菌株进行改造。

芽孢杆菌属是一类革兰氏阳性菌，有较厚的细胞壁，因此芽孢杆菌转化困难及转化效率低的问题一直备受关注。Sipizizen于1958年针对芽孢杆菌属的模式菌株-枯草芽孢杆菌168（Bacillus Subtilis 168）提出了一种化学转化方法，但转化效率不高，也未见更优方法的报道。纳豆芽孢杆菌（Bacillus Subtilis natto）是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种可直接食用的益生菌，同枯草芽孢杆菌168相比，纳豆芽孢杆菌培养过程中极易成链，形成较为稳定的多细胞聚合体，同时纳豆芽孢杆菌生产过程中会分泌多种蛋白，促进其形成胞外聚合物，使其更容易固定在生长基质上（如大豆、聚丙烯等），这导致纳豆芽孢杆菌的抗逆性更强，因此其转化难度更大。实测发现依据Sipizizen所述方法对纳豆芽孢杆菌进行菌种改造，重组质粒转化到纳豆芽孢杆菌感受态细胞中的转化率不足3cfu/μg。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳豆芽孢杆菌感受态细胞的制备及遗传转化方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种纳豆芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，包括下列步骤：

步骤1：将冷冻保藏的纳豆芽孢杆菌在LB固体培养基上划线，37℃条件下培养16-20h，在划线平板上挑一个单菌落，接种于盛有LB液体培养基的三角瓶中，37℃条件下以180-250rpm，摇床培养12-16h；

步骤2：取步骤1得到的培养液，接种于BN-Ⅰ培养基中，37℃条件下以180-250rpm，摇床培养12-16h；

步骤3：取步骤2得到的菌液接种于BN-Ⅰ培养基中，37℃条件下以180-250rpm，摇床培养4-5h；

步骤4：取步骤3得到的菌液接种于BN-II培养基中，37℃条件下以180-250rpm，摇床培养1-2h；

步骤5：向步骤4的菌液中加入促转化液，37℃条件下以80-120rpm，摇床培养10-30min；培养结束后得到含有感受态细胞的菌液；

每100毫升的BN-Ⅰ培养基含有：1.47ml的BN-A溶液，1.47ml的BN-B溶液，0.03ml的100×CAYE溶液和0.03ml的质量分数为50%的木糖溶液；