[发明专利]一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法

说明书

本发明的硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，包括以下步骤：步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物。本发明自然界微生物库中存在广泛的各类基因资源，本研究从除草剂污染的土壤中分离筛选到一株硝磺草酮高耐受菌株MST‑5，从中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd，利用E.coli BL21(DE3)对StHPPD进行了异源表达和纯化，研究了StHPPD对硝磺草酮的抗性，旨在为新型除草剂抗性基因的发掘和应用提供基础材料。

技术领域

本发明涉及硝磺草酮技术领域，具体涉及一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法。

背景技术

草甘膦和抗草甘膦作物的组合在农作物转基因领域超过20年的大面积持续应用，对全球范围农田杂草的控制起到了非常大的作用。然而，长期高剂量使用草甘膦造成了严重的环境危害和巨大的选择压力，已经导致了40多种杂草对草甘膦产生了抗药性。草甘膦及其抗性基因替代组合的发掘和应用，是植物转基因领域重要且紧迫的研究任务之一。

4-羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂类除草剂是近年来新开发的一类新型白化型除草剂，其除草机理是通过竞争性抑制植物酪氨酸代谢途径中HPPD的活性，从而使质体醌和生育酚的合成受阻，间接影响了类胡萝卜素的合成和功能，使植物光合作用不能正常进行，导致杂草叶片白化，组织坏死，最终死亡。HPPD抑制剂类除草剂广泛应用于防治玉米田中的阔叶杂草和禾本科杂草，具有环境安全性高、作物安全性好和杂草抗性产生慢等优点，被认为是替代草甘膦的转基因作物靶标除草剂。HPPD抑制剂类除草剂主要品种有硝磺草酮、苯吡唑草酮和异噁唑草酮，其中硝磺草酮是用量最大的一类。目前，巴斯夫和先正达利用来自于燕麦的HPPD突变体AvHPPD-03开发出抗硝磺草酮的转基因大豆SYHT0H2并已进行了商业化生产，而国内仅克隆出了3个抗HPPD基因，尚无高抗硝磺草酮的HPPD基因的报道。

基于此，本发明提供一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，包括以下步骤：

步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；

步骤二：然后将5mL培养物转移到50mL新鲜的MSM培养基中，继续培养5d，经过连续富集驯化5轮后，吸取1mL上清培养液并稀释涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生长的单菌落反复划线，获得纯培养物，并经革兰氏染色法筛选获得其中的阴性菌；

步骤三：纯化得到的革兰氏阴性菌株转接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生长的菌株，然后转接到新的筛选平板上，转接过程中逐渐增加筛选平板上硝磺草酮的浓度以增加选择压力，最终筛选出硝磺草酮高度耐受菌株；

步骤四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因组DNA为模板，根据引物对pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR扩增其hppd基因，对PCR产物进行回收纯化，然后利用同源重组的方式克隆至线性化的pET-29a(+)载体，构建好的pET-Sthppd表达载体转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，StHPPD重组蛋白在16℃、160r/m摇床中过夜诱导表达，利用Co2+柱进行蛋白纯化；

步骤五：将纯化的硝磺草酮抗性菌株进行筛选处理。