[发明专利]一种鉴定牛肉成分的分子标记及其应用

说明书

本发明公开一种鉴定牛肉成分的分子标记及其应用，通过基于SYBR Green I染料的实时荧光定量PCR技术，利用细胞核中牛的单拷贝基因作为分子标记，建立具有特异性强、灵敏度高的牛肉成分检测的方法。本发明建立的方法可以准确区分牛与其他12种动物和6种植物，对9种市场上的肉制品进行实际检测，可准确判断出是否含有牛源性成分。本发明建立的牛特异性实时荧光定量PCR检测方法可以为混合肉制品中牛源性成分的定性、定量检测提供技术参考。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定食品中牛肉成分的分子标记 及其应用。

背景技术

牛属于动物界(Animalia)，脊索动物门(Chordata)，哺乳纲(Mammalia)，偶 蹄目(Arti odactyla)，牛科(Bovidae)，牛亚科(Bovinae)，牛属(Bos)。牛肉是优 质肉类食品，其所含必须氨基酸品种多、含量高且氨基酸组成与人体氨基酸组成 接近，具强健筋骨、滋养脾胃等功效。随着人们对牛肉食用营养价值的认可度提 升以及西餐文化的影响，牛肉消费市场不断扩大；同时，近年的非洲猪瘟使我国 居民肉类消费结构中，作为仅次于猪肉、禽类的世界第三消耗肉品的牛肉占比持 续上涨。然而受各类因素影响，我国牛肉生产量远小于需求量，需依靠进口以填 补缺口，牛肉价格不断提高。

许多经过加工、冷冻、冷藏的食品从外观上很难辨别肉类成分，在没有明确 标签的情况下，为了经济效益，不法商家将商业价值低的肉制品冒充或是掺入价 值高的肉制品中，会对消费者进行误导，甚至是欺骗消费者。同时在销售肉制品 方面缺失标签这种行为造成消费者恐慌的现象也不断出现。在国家加强肉类掺假 监管力度的情况下，仍存在较多生产商家用成本低于牛肉的猪肉、鸭肉、鸡肉或 大豆掺假甚至完全替代牛肉以谋取利益，其中以餐饮店最为严重，不仅会损害消 费者利益，甚至会造成传染病、特定人群的过敏或代谢紊乱等健康隐患。

通常，在现有技术中对于物种的鉴定采用蛋白质鉴定方法或DNA条形码技 术。蛋白质鉴定方法是鉴定物种的一种相对成熟及有效的方法，包括电泳、色谱 和免疫学检测。基于蛋白质的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是免疫学鉴定的一种方法，ELISA是基于抗原抗体特异性反应和 酶与底物专一性反应，在肉制品的检测中，可通过肉眼观察反应产物颜色来判断 成分物种来源。目前可以通过此方法检测的物种包括牛、猪、马、绵羊、鱼、家 禽等。但是，蛋白质检测方法却具有以下限制性：1、不易检测腌制食品和深度 加工的食品，因为大部分蛋白质会在动物死亡后或高温、高压等深度加工后发生 变性，从而改变其抗原性；2、不适合混合肉制品的检测，因为目前的抗体特异 性不显著，可能对不同的动物蛋白质有交叉反应，所以无法通过检测混合肉制品 中的蛋白质来推断动物物种来源。

DNA条形码技术也是物种鉴定的方法之一，其方法是利用线粒体基因中编 码细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome c oxidase subunit 1,COI)的短核酸序 列、线粒体中D环区域或者是12S rRNA上的核酸序列。通过对不同物种中的这些 核酸序列进行测序和序列比对分析，找到一些具有物种特异性的位点，作为该物 种的DNA条形码。目前，已被广泛应用于鉴定鸟类、水生动物、昆虫和哺乳动 物。然而，目前对于食品中牛肉成分的检测，大多数都是使用线粒体DNA来鉴 定，如牛肉的12S rRNA，牛肉细胞色素c上的基因，线粒体中D环区域上的核苷 酸序列。由于不同细胞中线粒体数量不同，线粒体DNA拷贝数在不同组织也会 有所不同，因此并不适合进行定量检测。

由此可见，如何获得一种能够代表牛的基因组拷贝数和细胞数DNA分子标 记，进而达到对肉制品中的牛肉成分进行精确鉴定和定量检测，是目前急需解决 的问题。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，发明人通过多次，反复的实验和摸索获得了能 够代表牛的基因组拷贝数和细胞数DNA分子标记，设计出灵敏度高，特性好的 扩增引物并摸索出适合该引物的扩增体现和程序，实现了精确鉴定和定量检测肉 制品中牛肉成分的目的。