[发明专利]重金属铅检测试剂盒及方法

说明书

本发明属于重金属铅检测技术领域。针对现有的重金属铅的检测技术存在的环境适应性差、效率低的问题，提供一种重金属铅检测试剂盒及方法。本发明通过两步脱氧核酶酶切反应实现多级信号放大。首先，Pb²⁺特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成引发第二步酶切反应的线性双发卡脱氧核酶；然后，线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb²⁺转化为强荧光信号。本发明真正实现各种环境和温度下的Pb²⁺快速、灵敏的现场检测。

技术领域

本发明属于重金属铅检测技术领域，具体涉及一种重金属铅检测试剂盒及方法。

背景技术

重金属污染对环境危害严重，且能通过生物链蓄积进入人体，对人类健康及生命安全造成威胁。其中铅离子因其用途广、毒性大而受到普遍关注。因此，食品安全和环境检测等过程中对微量铅的检测十分必要。

传统的铅检测方法主要有原子吸收光谱法和荧光光谱法等，需要借助昂贵的大型仪器，检测成本高且操作复杂，适合精准的定量分析，不适用于现场快速检测或对大量样品的现场初筛。近年来，研究者们开发了多种基于脱氧核酶的核酸传感器用于铅、镉等重金属的检测中。比如，有研究者将两端分别标记荧光和淬灭基团的底物链设计成分子内的茎环结构，保证荧光基团和淬灭基团紧密接触，当底物链被切断后，茎环结构转变为两条游离短链，释放荧光信号。然而，这类核酸传感器是基于单个脱氧核酶的传感器，仅有单次信号放大，效率较低，检测灵敏度也难以提高。此外，一些多次信号放大的核酸传感器大多需要核酸外切酶或聚合酶等蛋白质类酶的参与，这些蛋白质试剂需要低温保藏，且对反应温度要求严格，不适用于各种温度和环境下的现场检测。鉴于目前重金属快速检测技术的诸多不足之处，研发一种操作简便、环境适应性强、快速、灵敏地现场检测重金属铅的技术具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有的重金属铅的检测技术存在的环境适应性差、效率低的上述问题，本发明提供一种重金属铅检测试剂盒及方法。本发明的检测原理是：通过两步脱氧核酶酶切反应实现多级信号放大。首先，Pb²⁺特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成引发第二步酶切反应的线性双发卡脱氧核酶；然后，线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb²⁺转化为强荧光信号。本发明真正实现各种环境和温度下的Pb²⁺快速、灵敏的现场检测，最终应用于实际样品的现场检测或大量样本的前期初筛中。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种重金属铅检测试剂盒，所述试剂盒包括pb²⁺特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标及缓冲液，不包括蛋白质类酶或抗体；

所述pb²⁺特异性脱氧核酶是一类具有催化功能的DNA分子，其空间结构中存在活性中心，当其专一地与pb²⁺结合时，活性中心被激活；

所述环状双发卡脱氧核酶为在脱氧核酶的活性中心的第7-8个碱基或第8-9个碱基位置添加两个发卡结构，且脱氧核酶的线性形式通过首尾连接得到的单链环状序列；所述环状双发卡脱氧核酶中含有核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述的核糖核苷酸位点为pb²⁺特异性脱氧核酶的酶切位点；当所述酶切位点被酶切后，环状双发卡脱氧核酶断裂形成线性双发卡脱氧核酶；

所述分子信标含有与所述线性双发卡脱氧核酶结合臂的互补核酸片段，所述互补核酸片段的中间段为核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述核糖核苷酸位点为线性双发卡脱氧核酶的酶切位点；所述分子信标带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团位于所述双发卡脱氧核酶的酶切位点的两侧。