[发明专利]一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒用于检测氨甲喋呤代谢标志物ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)和SLCO1B1(c.1865+4846TC)基因多态性。本发明以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对甲氨喋呤药物剂量及不良反应预测相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)、SLCO1B1(c.1865+4846TC)基因多态性甲氨喋呤药物，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

技术领域

本发明涉及一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是一种叶酸拮抗剂，通过结合二氢叶酸还原酶，使四氢叶酸生成障碍来干扰DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞增殖。HDMTX化疗可引起多种毒副反应，主要有骨髓抑制，表现为白细胞减少，严重时可有全血抑制，胃肠道反应除常见的恶心、呕吐等，还有口腔、肛周等黏膜溃疡。大剂量或长期应用时可使肝肾功能受损。而化疗药物引起的不良反应致化疗暂停或终止，影响疾病结果。药物基因组学研究显示与药物转运、代谢、作用靶点相关基因的单核苷酸多态性(SNP)是决定药物疗效和不良反应的关键因素之一。

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢途径的限速酶之一，可以将5,10-二甲基四氢叶酸催化还原为5-甲基四氢叶酸，对于DNA的合成、活化及修复起着关键的调控作用；该酶的677C-T遗传多态会严重的影响酶活性，从而导致一系列的反应，最重要的不良反应是氨甲喋呤药物的毒性反应。另外，甲氨蝶呤的转运体主要有两类：三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP－binding cassette,ABC转运体)和溶质蛋白转运体家族(Solution carrier,SLC家族)。

ABCB1是一个磷酸化和糖基化的跨膜外向转运蛋白，为ATP-结合盒蛋白(ATPbinding cassette transporter)家族中最重要的遗传物质，ABCB1基因位于人类7号染色体长臂21区(7q21)上，能够编码一种ATP依赖性外排泵P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，可以将细胞内的药物转运至细胞外，从而导致耐药的产生。ABCB1 C3435T位于第26号的外显子上，ABCBl基因的C3435T在不改变编码氨基酸序列的情况下，通过影响编码蛋白质的二级结构，从而改变P-gp对其底物的特异性，P-gp功能或表达水平可改变MTX在体内的药代动力学，从而改变靶细胞内的有效浓度，最终影响治疗效果。

SLCO1B 1基因编码的有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)是体内主要的摄取转运体之一，介导多种外源性和内源性物质从血液向肝细胞的跨膜转运。SLCO1B1具有高度遗传多态性，其基因多态性可影响OATP1B1的转运能力目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以多重RPA扩增和焦磷酸测序技术为基础，获得一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：