[发明专利]一种生物合成乙醇的构建体，菌株以及生产乙醇的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物合成乙醇的构建体，菌株以及生产乙醇的方法。本发明利用光强启动子Pcpc560驱动丙酮酸脱羧酶和NADPH依赖型醛还原酶yqhd基因在蓝细菌中一个和多个基因位点表达，利用分子技术首次对丙酮酸代谢反向的蓝藻内源途径进行敲除从而构建合成具有高乙醇产量的基因工程蓝藻。本发明首次成功地在集胞藻PCC6803中构建了一条高效合成生物乙醇的代谢途径，可提高乙醇合成前体丙酮酸含量，实现乙醇在集胞藻PCC6803体内的高效合成，具有良好的可行性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物合成乙醇的构建体，菌株以及生产乙醇的方法。

背景技术

随着化石燃料的枯竭，可再生能源的发展受到了极大的关注。蓝藻(Cyanobacteria)是一种可以进行厌氧型光合作用的大型单细胞原核生物，其光合作用并以水为电子受体进行放氧。使整个地球大气从无氧状态发展到有氧状态，从而孕育了一切好氧生物的进化和发展。蓝藻作为碳固定场所，可以固定大气中的CO₂。目前，利用工程蓝藻生产可再生生物燃料乙醇”，在可再生能源问题上受到越来越多的重视。集胞藻PCC6803(Synechocystis sp)是一种单细胞球形蓝藻，能利用光能进行自养生长，又能利用葡萄糖进行异养生长。随着基因组全序列测定的完成，它简单遗传背景逐渐被人们所认识，并常被用作研究蓝藻生理特点和基因调控的模式生物。

集胞藻目前已被作为微生物细胞工厂，通过基因工程改造后已成功合成多种高价值分子产品，如乙醇，乙烯,丙酮,异戊二烯,异丁醇、中长链脂肪酸、脂肪醇、脂肪烃以及胞外多糖等重要物质。自从Deng and Coleman报告第一例乙醇基因工程产生于蓝藻PCC7942，在rbcLS作为启动子的控制下表达了丙酮酸脱羧酶和乙醇运动发酵单胞菌脱氢酶，乙醇积累量达到约5mM(0.23g/L)。随后，Dexter和Fu证明可以在集胞藻PCC6803中产生生物乙醇，产量达到10mM(0.46g/L)。但从生物合成量的角度来说，目前利用集胞藻合成生物活性物质所获得的实际产量远低于理论目标产值。因此，优化集胞藻合成代谢途径的关键酶或基因及提高蓝藻的有效资源化利用率成为工业生产应用的重要瓶颈，其开发技术有待进一步研究。

发明内容

有鉴于此，为了增加乙醇的生产能力，本发明提供了一种生物合成乙醇的构建体，菌株以及生产乙醇的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明的一方面通过高效启动丙酮酸脱羧酶和NADPH依赖型醛还原酶，并提高其活性，进而提高乙醇产量，实现利用蓝细菌高效合成生物乙醇的目的。

在本发明的另一个方面，在集胞藻PCC6803中构建一条高效合成生物乙醇的代谢途径，实现乙醇在集胞藻PCC6803体内的合成。

本发明提供了一种能高效产生乙醇的构建体，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作的连接第一基因和第二基因；其中，第一基因为丙酮酸脱羧酶基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，第二基因为NADPH依赖型醛还原酶基因，其序列如SEQ ID NO.3；所述的具有活性的启动子是光强启动子Pcpc560，其序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述构建体中敲除了磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶。

更进一步地，所述构建体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，从而所述构建体可以通过同源重组整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置，所述蓝细菌基因的上游片段和下游片段为集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列和C-末端序列，或集胞藻PCC6803的slr0301基因的N-末端序列和C-末端序列；所述slr0301基因的N-末端序列如SEQ ID NO.4所示，slr0301基因的C-末端序列如SEQ ID NO.5所示。