[发明专利]一种获取金银花腺毛组织的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获取金银花腺毛组织的方法，所述的方法首先切除金银花花蕾上部，避免花粉干扰；其次通过液氮低温冷却结合旋涡混合仪振荡摩擦的方法，高效快速的脱落表皮腺毛组织；最后先后通过100μm细胞滤网过滤和70μm的细胞滤网过滤，成功分离得到金银花高质量腺毛组织。本发明是第一次在收集金银花腺毛中使用液氮低温冷却结合旋涡混合仪振荡摩擦的方法，通过细胞滤网过滤，建立了金银花腺毛组织的纯化技术，优化了收集金银花腺毛的传统冻刷法，既避免了花粉粒的干扰，又减少了人力物力的消耗，提高了效率，获得了高纯度的腺毛组织。该方法获得的金银花腺毛组织纯度高，为进一步研究腺毛组织的内含物及分子生物学奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获取金银花腺毛组织的方法。

背景技术

腺毛是植物的一种重要的表皮组织，根据分泌行为不同，可分为非分泌型腺毛与分泌型腺毛两种类型。非分泌型腺毛顶端缺乏合成和储存细胞，不具备合成和积累次生代谢产物的能力；分泌型腺毛可合成、储存或分泌大量次生代谢产物(Konarska，2020)，该类型腺毛蕴含着十分复杂的次生代谢产物，包括萜类、黄酮类、生物碱类、木质素类、多糖类、糖苷类、脂肪酸类、蛋白质类、生物碱类等多种化学成分(Balcke，2017)。中药材活性成分多为植物次生代谢产物，因此以植物的腺毛为切入点，探索中药材的品质，具有巨大的研究价值。

目前腺毛的分离和纯化方法中，最常用的有化学试剂直接提取法和机械分离法。化学试剂直接提取法常用的有二氯甲烷提取法(马旭东等，2021)，尽管这种方法简便快捷，无需对腺毛进行分离及纯化富集，但得到的并非腺毛提取物，而是植物组织的有机溶剂提取物，所以对这种实验结果的精确性尚存在质疑。机械分离技术常用的有冻刷法，即将含有腺毛组织的叶片置于液氮中冷冻2min，之后用软硬适中的刷子刷取腺毛(蒋征等，2016)，在短时间内获得大量腺毛。不过，采用冻刷法刷取较薄的叶片腺毛时，例如薄荷，藿香等植物叶片腺毛，冷冻的叶片极为破碎，获取的腺毛中含有大量的植物组织碎片。该方法虽从某种程度上实现了腺毛的分离，但植物腺毛的大小、形状、种类繁多，纯化方法在不同物种间存在适用性障碍。腺毛组织的分离与纯化是腺毛研究的技术核心与难点。

金银花是忍冬科植物忍冬Lonicerajaponica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，是我国的常用中药材，性甘、寒，具有清热解毒、疏散风热的功效，临床上用来治疗风热感冒、风温感冒、疮痈肿毒，亦能治疗各种热症(于良富，2016；黄勇等，2012；马玲，1997)。金银花腺毛本身对植物的正常生长与生理活动起着重要的调节作用，在中药材质量评价、品种选育及道地性研究中占据重要地位(李建军等，2013；吴飞燕等，2014；张山山等，2015；王玲娜等，2016)。因而通过精准化分析金银花腺毛中内含物种类、含量与分布，对金银花药材质量控制，品种选育等工作具有重要意义。然而，在植物中如何高效获取高纯度的腺毛组织仍然是一道技术难题。

很久之前就有学者采用冻刷法获取植物腺毛组织(蒋征等，2016)，不过液氮冷冻后用刷子刷取金银花腺毛效率相对较低，而且金银花花蕾极易破裂，导致刷取物中混入花粉粒。因此传统冻刷法，不适用于金银花腺毛组织的分离，并且耗时长，效率相对较低。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术的缺点与不足，提供一种获取金银花腺毛组织的方法，采用本发明可以获得高纯度金银花腺毛组织。

本发明所述的一种获取金银花腺毛组织的方法，特点在于，将金银花花蕾依次经过低温冷冻、振荡摩擦、二级细胞滤网过滤分离，得到高纯度的腺毛组织。

其具体步骤为：

(1)将采集的金银花花蕾预处理；

(2)将离心管置于冰块中预冷，向预冷的离心管中加入预处理好的金银花花蕾，轻轻震荡，使花蕾在离心管中排列紧密；