[发明专利]同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法有效
申请号: | 202110662951.5 | 申请日: | 2021-06-15 |
公开(公告)号: | CN113481278B | 公开(公告)日: | 2022-04-12 |
发明(设计)人: | 王小平;刘忠莹;雷激;王鑫;黄泽玮;陆阳;张定秋 | 申请(专利权)人: | 四川省食品检验研究院;西华大学 |
主分类号: | C12Q1/40 | 分类号: | C12Q1/40;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/64;G01N30/86 |
代理公司: | 成都科海专利事务有限责任公司 51202 | 代理人: | 黄幼陵 |
地址: | 611731 四*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 同时 测定 蔗糖 活力 聚糖 方法 | ||
1.同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法,其特征在于以蔗糖为底物,在蔗糖溶液中加入被测蔗糖酶或果聚糖酶酶解蔗糖形成含葡萄糖和果糖的第一酶解液,然后用硼氢化钠将第一酶解液所含葡萄糖和果糖转化成甘露醇和山梨醇,再向含甘露醇和山梨醇的蔗糖溶液中加入被测果聚糖酶或蔗糖酶酶解蔗糖得到含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的试样;将含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的试样用离子色谱-脉冲安培法测定其所含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的含量,通过试样中甘露醇和山梨醇的含量计算蔗糖酶或果聚糖酶的活力,通过试样中葡萄糖和果糖的含量计算果聚糖酶或蔗糖酶的活力。
2.根据权利要求1所述同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法,其特征在于操作步骤如下:
(1)试样的制备
①蔗糖酶、果聚糖酶和蔗糖溶液的配制
用pH 6.0的乙酸钠缓冲液分别溶解被测蔗糖酶、被测果聚糖酶、底物蔗糖,得到浓度为1~10U/mL的蔗糖酶溶液、浓度为1~10U/mL的果聚糖酶溶液及浓度为0.1~0.5mol/L的蔗糖溶液;
②蔗糖酶酶解蔗糖
将0.1~0.5mL步骤①配制的蔗糖溶液加入刻度为25~50mL的试管中,再将0.01~0.02mL步骤①配制的蔗糖酶溶液加入所述试管中,混合均匀后在37℃恒温水浴中保温10~20min酶解蔗糖,然后置于沸水浴中加热3~5min终止酶促反应后取出冷却至室温,形成含葡萄糖和果糖的第一酶解液;
③葡萄糖和果糖转化为相应醇
向步骤②形成的含葡萄糖和果糖的第一酶解液中加入1.0~2.0mL浓度为10~20mg/mL的硼氢化钠溶液并混合均匀,然后置于60±5℃的恒温水浴摇床中振摇30~40min后取出冷却至室温形成含甘露醇和山梨醇的蔗糖溶液,再加入1~3mL体积浓度为0.5~1.0%的乙酸溶液并混合均匀后用氢氧化钠溶液调pH值为6.0;
④果聚糖酶酶解蔗糖
在步骤③所得溶液中加入0.01~0.02mL步骤①配制的果聚糖酶溶液并混合均匀,然后置于55℃恒温水浴中保温10~20min酶解蔗糖,再置于沸水浴中加热3~5min终止酶促反应后取出冷却至室温,形成含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的第二酶解液,再后用去离子水定容至所述试管的刻度作为试样;
(2)标样和淋洗液的配制
用山梨醇、甘露醇、葡萄糖、果糖和去离子水配制一系列山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖浓度不同的水溶液作为标样;
淋洗液为去离子水、去离子水配制的氢氧化钠溶液及氢氧化钠和乙酸钠混合液,所述氢氧化钠溶液的浓度为50~200mmol/L,所述混合液中,氢氧化钠的浓度为50~150mmol/L,乙酸钠的浓度为200~500mmol/L;
(3)试样中山梨醇、甘露醇、葡萄糖、果糖浓度的测定
使用配有电化学检测器、pH-Ag/AgCl复合参比电极的高压离子色谱仪对试样和标样进行检测,得到试样谱图和一系列标样谱图;以标样的浓度为横坐标、以标样谱图的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,根据试样谱图的峰面积和标准曲线得到被测试样中山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖的浓度;
(4)蔗糖酶和果聚糖酶活力的计算
①蔗糖酶活力的计算
根据步骤(3)所得山梨醇浓度、甘露醇浓度,用下述公式计算,得到蔗糖酶活力,
式中:
X1,蔗糖酶活力,单位为U/mL;
C1,试样中山梨醇的浓度,单位为μg/mL;
C2,试样中甘露醇的浓度,单位为μg/mL;
V,试样的最终定容体积,单位为mL;
M1,山梨醇的摩尔质量,182g/mol;
M2,甘露醇的摩尔质量,182g/mol;
Vx1,制备试样时蔗糖酶溶液取用体积,单位为mL;
t1:制备试样时蔗糖酶酶解蔗糖的时间,单位为min;
②果聚糖酶活力的计算
根据步骤(3)所得葡萄糖浓度、果糖浓度,用下述公式计算,得到果聚糖酶活力,
式中:
X2,果聚糖酶活力,单位为U/mL;
C3,试样中葡萄糖的浓度,单位为μg/mL;
C4,试样中果糖的浓度,单位为μg/mL;
V,试样的最终定容体积,单位为mL;
M3,葡萄糖的摩尔质量,180g/mol;
M4,果糖的摩尔质量,180g/mol;
Vx2,制备试样时果聚糖酶溶液取用体积,单位为mL;
t2,制备试样时果聚糖酶酶解蔗糖的时间,单位为min。
3.根据权利要求1所述同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法,其特征在于操作步骤如下:
(1)试样的制备
①蔗糖酶、果聚糖酶和蔗糖溶液的配制
用pH 6.0的乙酸钠缓冲液分别溶解被测蔗糖酶、被测果聚糖酶、底物蔗糖,得到浓度为1~10U/mL的蔗糖酶溶液、浓度为1~10U/mL的果聚糖酶溶液及浓度为0.1~0.5mol/L的蔗糖溶液;
②果聚糖酶酶解蔗糖
将0.1~0.5mL步骤①配制的蔗糖溶液加入刻度为25~50mL的试管中,再将0.01~0.02mL步骤①配制的果聚糖酶溶液加入所述试管中,混合均匀后在55℃恒温水浴中保温10~20min酶解蔗糖,然后置于沸水浴中加热3~5min终止酶促反应后取出冷却至室温,形成含葡萄糖和果糖的第一酶解液;
③葡萄糖和果糖转化为相应醇
向步骤②形成的含葡萄糖和果糖的第一酶解液中加入1.0~2.0mL浓度为10~20mg/mL的硼氢化钠溶液并混合均匀,然后置于60±5℃的恒温水浴摇床中振摇30~40min后取出冷却至室温形成含甘露醇和山梨醇的蔗糖溶液,再加入1~3mL体积浓度为0.5~1.0%的乙酸溶液并混合均匀后用氢氧化钠溶液调pH值为6.0;
④蔗糖酶酶解蔗糖
在步骤③所得溶液中加入0.01~0.02mL步骤①配制的蔗糖酶溶液并混合均匀,然后置于37℃恒温水浴中保温10~20min酶解蔗糖,再置于沸水浴中加热3~5min终止酶促反应后取出冷却至室温,形成含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的第二酶解液,再后用去离子水定容至所述试管的刻度作为试样;
(2)标样和淋洗液的配制
用山梨醇、甘露醇、葡萄糖、果糖和去离子水配制一系列山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖浓度不同的水溶液作为标样;
淋洗液为去离子水、去离子水配制的氢氧化钠溶液及氢氧化钠和乙酸钠混合液,所述氢氧化钠溶液的浓度为50~200mmol/L,所述混合液中,氢氧化钠的浓度为50~150mmol/L,乙酸钠的浓度为200~500mmol/L;
(3)试样中山梨醇、甘露醇、葡萄糖、果糖浓度的测定
使用配有电化学检测器、pH-Ag/AgCl复合参比电极的高压离子色谱仪对试样和标样进行检测,得到试样谱图和一系列标样谱图;以标样的浓度为横坐标、以标样谱图的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,根据试样谱图的峰面积和标准曲线得到被测试样中山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖的浓度;
(4)蔗糖酶和果聚糖酶活力的计算
①蔗糖酶活力的计算
根据步骤(3)所得葡萄糖浓度、果糖浓度,用下述公式计算,得到蔗糖酶活力,
式中:
X1,蔗糖酶活力,单位为U/mL;
C3,试样中葡萄糖的浓度,单位为μg/mL;
C4,试样中果糖的浓度,单位为μg/mL;
V,试样的最终定容体积,单位为mL;
M3,葡萄糖的摩尔质量,180g/mol;
M4,果糖的摩尔质量,180g/mol;
Vx1,制备试样时蔗糖酶溶液取用体积,单位为mL;
t1:制备试样时蔗糖酶酶解蔗糖的时间,单位为min;
②果聚糖酶活力的计算
根据步骤(3)所得山梨醇浓度、甘露醇浓度,用下述公式计算,得到果聚糖酶活力,
式中:
X2,果聚糖酶活力,单位为U/mL;
C1,试样中山梨醇的浓度,单位为μg/mL;
C2,试样中甘露醇的浓度,单位为μg/mL;
V,试样的最终定容体积,单位为mL;
M1,山梨醇的摩尔质量,182g/mol;
M2,甘露醇的摩尔质量,182g/mol;
Vx2,制备试样时果聚糖酶溶液取用体积,单位为mL;
t2,制备试样时果聚糖酶酶解蔗糖的时间,单位为min。
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