[发明专利]用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针

权利要求书

1.用于检测第一和第二靶核酸中的一个或两者之存在的方法，其包括：

(a)将样品至少与第一和第二靶特异性引物-探针组接触，每个引物-探针组包含：

(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；

(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；

(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和

(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，

其中所述第一和第二测定探针的一个经报告基团标记，而另一个经淬灭基团标记；以及

其中所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且其中所述第一引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点可与所述第二引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点区分开；

(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将样品与所述引物-探针组的靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；

(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；

(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；

(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针；

(f)通过检测所述第一和/或第二引物-探针组的第一或第二测定探针上报告基团信号的未淬灭来检测靶核酸；以及

(g)通过对所述第一和第二测定探针进行熔链曲线分析来确定所述第一靶特异性引物-探针组、第二靶特异性引物-探针组或两者的第二测定探针是否被切割，其中对应于特定第一和第二测定探针组之熔链峰的减少或消失指示所述第二测定探针被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引物-探针组的报告基团与所述第二引物-探针组的报告基团相同。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸，所述第二测定探针至少包含至少与所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一或第二测定探针的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述第一测定探针的第二区域包含2至5个非天然核苷酸，所述第二测定探针包含与所述第一测定探针的所述2至5个非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸。

6.至少检测第一靶核酸之存在的方法，其包括：

(a)将样品与第一靶特异性引物-探针组接触，所述引物-探针组包含：

(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；

(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；

(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和

(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，

其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团；

(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；

(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将标签序列从所述靶特异性探针释放；

(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；

(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的第二测定探针；以及

(f)通过检测所述第一或第二测定探针上报告基团信号的未淬灭，来至少检测第一靶核酸。

7.如权利要求6所述的方法，其中报告基团为荧光团。

8.如权利要求7所述的方法，其中信号的未淬灭为荧光信号的提高。