[发明专利]研究淡水超微真核藻群落结构多样性的固定方法

说明书

本发明涉及一种研究淡水超微真核藻群落结构多样性的固定方法，属于环境科学超微真核藻细胞数和群落结构监测和研究技术领域。按区域将水体划分为上、中和下游三个采样区域，且分别对每个区域分为上中下层的水样，等分区域并设置采样点，在不同采样点通过采水器每隔两小时取样一次，并将所有采集的水体混合，得到待固定水样置于离心管中，加入泊洛沙姆溶液作为固定剂，进行混匀并静置，得到混合样品。将混合样品置于液氮中进行速冻。将速冻好的混合样品拿出，放入超低温冰箱冷藏，得到保藏样品。拿出保藏样品解冻，得到固定后样品。本发明不仅能保持超微真核藻丰度一致，更能维持超微真核群落多样性和群落结构稳定，并且适用于各湖泊样品。

技术领域

本发明涉及一种研究淡水超微真核藻群落结构多样性的固定方法，属于环境科学超微真核藻细胞数和群落结构监测和研究技术领域。

背景技术

超微藻由于其细胞微小，许多类群缺乏明显的形态学特征，利用传统的显微镜观察法难以区分鉴别；直到21世纪初，分子生物学的迅速发展，才使得人们对超微藻多样性有了进一步的认识。根据细胞结构，超微藻可分为原核超微藻和真核超微藻。超微型真核藻并不是指系统进化阶元上的某一分类类群，而是代表粒径小于3 μm的所有真核浮游藻类的总称，因此它的物种组成十分复杂，多样性极高，可能是地球上数量最多的真核生物，淡水中的超微型真核藻直到近几年才受到广泛关注，对其的认识还十分有限。通过流式细胞术结合18S的rRNA基因高通量测序是现有的研究超微真核藻多样性的最好方法。超微藻样品采集后通常需要立即进行测定，一般情况下，样品采集后为防止细胞荧光信号消失或者自溶应当立即进行分析。因为室温条件下温度变化较为频繁，且细胞处于该环境中仍会继续进行细胞代谢，导致代谢产物堆积甚至酸中毒，代谢紊乱，造成死亡，进而被微生物所分解，最终致使结果偏差较大。故应该即采即测，如若无法即刻处理则应进行固定处理，即刻中止或抑制细胞代谢，从而保证样品极大程度上处于最初的采集状态，减小测定误差。超微真核藻样品的保存，一方面要求保持藻的自发荧光，另一方面还要保证藻在低温下的细胞完整。

国内外有关超微藻等浮游藻类固定方法的研究颇多，目前常见的浮游藻类固定剂有Lugol试剂、福尔马林（含甲醇）、乙醇、戊二醛、甲醛等，但是不同的固定方法对藻类荧光及DNA的影响不同。其中大多数常用试剂会对超微藻细胞的荧光信号或者细胞形态造成重大影响，如有Lugol试剂、福尔马林（含甲醇）、乙醇等，因此不能将其用作超微藻样品的固定。不少研究学者发现醛类溶液，如甲醛、戊二醛等，能较大程度上保持细胞形态结构以及细胞器的完整性，但对藻细胞的荧光信号仍有影响。特别是通常只研究了这些固定方法对超微藻荧光特性的影响，并未进一步探索样品固定对超微真核藻群落结构的影响，即与新鲜样品的差异性。截至目前，尚缺乏能保持超微真核藻初始群落结构特征的样品固定方法。

发明内容

发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种研究淡水超微真核藻群落结构多样性的固定方法，不仅能保持超微真核藻丰度一致，更能维持超微真核群落多样性和群落结构稳定，并且适用于各湖泊样品。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种研究淡水超微真核藻群落结构多样性的固定方法，包括如下步骤：

步骤1：按区域将水体划分为上、中和下游三个采样区域，且分别对每个区域分为上中下层的水样，等分区域并设置采样点，在不同采样点通过采水器每隔两小时取样一次，并将所有采集的水体混合，得到待固定水样；

步骤2：将步骤1获得的待固定水样置于离心管中，加入体积占比为0.01%-0.05%的泊洛沙姆溶液作为固定剂，进行混匀并静置，得到混合样品；

步骤3：将步骤2中得到的混合样品置于液氮中进行速冻；

步骤4：将速冻好的混合样品拿出，放入超低温冰箱冷藏，得到保藏样品；

步骤5：拿出保藏样品解冻，得到固定后样品。

进一步的，所述步骤2中加入的泊洛沙姆的体积占比为0.01%。