[发明专利]羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用

权利要求书

1.一种羰基还原酶在生物合成光学纯托伐普坦中的应用，其特征在于，所述羰基还原酶由序列如SEQ：ID：NO:1所示的基因编码得到, 所述光学纯托伐普坦为R型托伐普坦。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在合成光学纯托伐普坦时，在反应体系中加入辅酶NADPH和金属离子，所述金属离子为Mg²⁺或Mn²⁺。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用游离的羰基还原酶合成光学纯托伐普坦时，反应体系pH为5.0-7.0，温度为28-50℃；应用固定化羰基还原酶合成光学纯托伐普坦时，反应体系的pH为5.0-9.0，温度为28-40℃。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羰基还原酶为固定化羰基还原酶，所述固定化羰基还原酶通过以下方法制备得到：

a、以PHBHHx和Fe₃O₄为原料，利用溶剂挥发法合成PHA磁性纳米微球；

b、分别克隆羰基还原酶基因和连接蛋白基因，所述连接蛋白基因为PhaP基因，将所述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因与双酶切后的质粒进行连接，构建包含羰基还原酶基因和连接蛋白基因的重组质粒；

c、将重组质粒转化到感受态细胞中，得到包含羰基还原酶基因和连接蛋白基因的融合表达菌株，诱导所述菌株进行表达，得到融合蛋白；

d、将步骤a合成的PHA磁性纳米微球与融合蛋白充分混合，然后磁吸分离后即得到所述固定化羰基还原酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤a中，将PHBHHx在50-60℃条件下溶解于二氯甲烷中，然后加入Fe₃O₄并进行超声分散；将所得液体滴加到浓度为1-3%的PVA中，混合均匀后进行旋蒸，再经离心、洗涤、冻干后得到PHA磁性纳米颗粒；步骤b中，使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对pET28a质粒进行双酶切，将所述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因与双酶切后的pET28a质粒进行连接；步骤c中，感受态细胞为感受态的E.coli BL21（DE3）；步骤d中，PHA磁性纳米颗粒与融合蛋白混合方式为：在2-5℃条件下，慢速摇动混合2-4h。