[发明专利]一种提取、分离、鉴定和验证黄酒中苦味肽的方法

权利要求书

1.一种黄酒中苦味肽，其特征在于，所述黄酒中苦味肽的氨基酸序列为Leu-Pro-Thr-Leu。

2.一种权利要求1所述的黄酒中苦味肽的分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）超滤膜分离：以花雕酒为研究对象，采用膜超滤法对其进行处理，由截留分子量5KD和3KDa的超滤膜将花雕酒酒液分离为I-1、I-2、I-3三个组分，其中I-1分子量为≥5KDa，I-2分子量为3～5KDa，I-3分子量为≤3KDa；

2）凝胶过滤层析：通过葡聚糖凝胶G-15对1)中得到的超滤组分I-3进行分离，在紫外检测器吸收波长220nm处得到八个吸收峰，分别命名为II-1、2、3、4、5、6、7、8，选择II-7组分进一步分析鉴定；

3）高效液相色谱分析：对2)中确定的关键苦味肽组分II-7进行高效液相色谱测定，验证了凝胶分离所得的II-7肽组分在220nm波长下具有紫外吸收，而且凝胶过滤层析的分离效果尚可，收集到的II-7肽组分可以用于下一步的结构鉴定；

4）结构鉴定：通过超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱对3)中确定的关键苦味肽组分Ⅱ-7的氨基酸序列进行了鉴定；

液相条件：洗脱液A为0 .1％乙腈水溶液，洗脱液B为0 .1％甲酸水溶液，洗脱程序为0-2min采用100％B；2-3min采用10％A和90％B，3-10min采用100％A；色谱柱为BEH C18色谱柱，5cm×2 .1mm×1 .7μm，柱温45℃；进样量10μL，流速为0 .3mL/min；

质谱条件：ESI+电离模式，离子源温度100℃；脱溶剂气化温度400℃；毛细管电压3.2KV；锥孔电压20KV，锥孔流速50L/h ,粒子能量1V，碰撞能量6V和20V；检测电压1700V；扫描时间1s，扫描范围20-10000m/z；

质谱鉴定在m/z 443附近的质谱丰度最强，对这个质谱峰进行碰撞诱导裂解，并进一步对照系统自带的Masslynx中的Biolynx对肽序列进行自动数据检索，最终得到一个分子量为508.5的肽序列，其序列为Leu-Pro-Thr-Leu。