[发明专利]区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法

权利要求书

1.一种末端唾液酸化异构糖肽生物标志物，其特征在于，用于区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽；共有6个，分别为：

MVSHH¹⁸⁴N#LTTGATLINE-H6N5S1；

MVSHHN#LTTGATLINE-H5N4F1S2；

MVSHHN#LTTGATLINE-H6N5S3；

NLFL²⁰⁷N#HSE-H5N4F1S2；

NLFL²⁰⁷N#HSE-H6N5S3；

VVLHP²⁴¹N#YSQVD-H6N5F1S3 ；

这里，糖链简写为：N -HexNAc ， H -Hex ，F-Fuc ，S - NeuAc ；

各标志物单独用于区分，或组合用于区分。

2.一种如权利要求1所述肝癌和正常人候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）纯化血清触珠蛋白：血清样本在10000～15000*g离心10～15分钟，随后使用HiTrap柱子进行纯化；结合柱上的Hp用洗脱缓冲液洗脱，后丙酮沉淀浓缩；

（2）Hp蛋白酶解：对于正常人和肝癌患者纯化的血清Hp，取体积浓度为1mg/mL的触珠蛋白，按1：20的体积比加入浓度为200～300mM二硫苏糖醇溶液，56～60 ℃下反应0.5～1h，进行蛋白质的变性和还原处理；随后按1：20的体积比加入400～600mM的碘乙酰胺溶液，室温下避光反应0.5～1h进行蛋白质的烷基化处理；最后按蛋白与胰蛋白酶50：1的体积比加入胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，在37 ℃酶解过夜，加入Glu-C消化继续酶解12～16h；最终加入10～20μL甲酸溶液进行酶解反应的终止；

（3）HILIC富集N-糖肽：首先用200～500μL平衡液平衡HILIC柱3～4次；再溶于平衡液的触珠蛋白酶解肽段上样3～4次后，用平衡液洗涤富集糖肽的HILIC柱3～4次；最后，用300～500μL 0.1% TFA的洗脱液洗脱富集在HILIC上的N-糖肽2～4次，合并洗脱液后真空离心干燥待用；

（4）LC-MS/MS分析：在线 LC 采用 Waters 公司 M-Class nano-LC 系统：A 相为 0.1% FA 水溶液；B 相为 0.1 % FA 的ACN 溶液；完整N-糖肽采用 on-column 上样，上样流速为 0.2～0.3 μL/min，上样 4～5 min；随后进入分析柱分离，色谱柱采用15～25 cm C18柱：采用60～90分钟的梯度，从1～2%的B相开始，40～60分钟后从35～40%的B相开始，5～10分钟后增加到80～85%的B相，然后调整到1～2% B相；

（5）N-糖肽数据检索：采用Byonic^TM软件检索触珠蛋白序列的原始数据文件，设定母离子和子离子的质量误差分别为10～20 ppm和0.03～0.05 Da；零缺失的切割位点被胰蛋白酶、V8蛋白酶消化；固定修饰为氨基甲酰化，变量修饰为氧化和去酰胺化；结果在1～1.2%FDR下进行过滤，Byonic评分150的置信阈值下进行手工验证；检索出的高可信N-糖肽用于末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查；

（6）末端唾液酸化异构糖肽生物标志物筛查中N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对比值定量分析：选用LC-MS/MS一致的色谱条件；在特定色谱保留时间下，触珠蛋白的各完整N-糖肽根据其m/z在四极杆中被分别选择并进行碰撞诱导解离，母离子所产生的全部碎片在离子淌度池中进行淌度分离，最终进入质谱检测器中检测并收集信号；喷雾电压为2.0～2.5 kV，锥孔电压为25～35 V，加热毛细管至 80～120 ℃，数据采用非数据依赖性模式/数据依赖性采集；淌度行波速度为 750～1100 m/s，波高最大设定在 35～40 V，N₂漂移气体流速为90～100 ml/min；糖肽的 CID能量采用从 15～50 V的梯度能量；数据采集一级扫描范围 100～2000 m/z，分辨率 20K，HDMS/MS扫描模式；

利用MassLyn 4.1 软件对各完整N-糖肽的α2,6和α2,3异构体B₃⁺碎片进行淌度到达时间分布提取；并根据其α2,6和α2,3异构体B₃+碎片的分布时间的峰面积相对比例，对正常人和肝癌患者血清Hp中完整N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接进行相对定量综合表征。